[发明专利]一种同时检测DNA多种甲基转移酶的生物传感器及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种同时检测多种DNA甲基转移酶的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器至少包括：哑铃式探针、环形模板和信号探针；

其中，所述哑铃式探针包括茎区域和位于茎区域两端的两个环区域；其中茎区域包含待测甲基转移酶的识别序列；

所述环形模板用于滚环扩增，其至少包括引物结合位点、Nb.BtsI的切口位点和与信号探针互补的片段；

所述信号探针用于触发Endo IV辅助信号放大反应，其至少含有一个脱嘌呤/脱嘧啶位点，所述AP位点两侧分别被荧光基团和猝灭基团修饰。

2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，当待测甲基转移酶为两个时，

在靠近第一环区域的位置设计第一待测甲基转移酶识别序列；在靠近第二环区域的位置设计第二待测甲基转移酶的识别序列；

所述环形模板和信号探针均为两个；

其中，

第一环形模板的引物结合位点与哑铃式探针在第一待测甲基转移酶识别序列处裂解释放裂解产物结合并引发RCA反应得第一DNA产物；

第二环形模板的引物结合位点与哑铃式探针在第二待测甲基转移酶识别序列处裂解释放裂解产物结合并引发RCA反应得第二DNA产物；

第一信号探针与上述第一DNA产物杂交结合形成带有AP位点的第一双链DNA，所述第一双链DNA被Endo IV裂解从而释放第一产物和第一荧光基团；所述第一产物继续结合第一信号探针杂交形成具有AP位点的DNA双链体，从而引发Endo IV诱导的第一信号探针的循环裂解反应，释放出大量第一荧光基团；

第二信号探针与上述第二DNA产物杂交结合形成带有AP位点的第二双链DNA，所述第二双链DNA被Endo IV裂解从而释放第二产物和第二荧光基团；所述第二产物继续结合第二信号探针杂交形成具有AP位点的DNA双链体，从而引发Endo IV诱导的第二信号探针的循环裂解反应，释放出大量第二荧光基团。

3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器还包括酶和缓冲液。

4.如权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述酶包括DpnI、GlaI、Vent(exo-)DNA聚合酶、Nb.BbtsI和核酸内切酶IV。

5.如权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，所述DNA甲基转移酶包括DNA腺嘌呤甲基转移酶和胞嘧啶甲基转移酶；

当所述第一待测甲基转移酶为Dam时，第一待测甲基转移酶识别序列为5'-G-A-T-C-3'；

当所述第二待测甲基转移酶为M.SssI时，第二待测甲基转移酶识别序列为5'-G-mC-G-C-3'。

6.权利要求1-5任一项所述生物传感器在DNA甲基转移酶中的应用；

优选的，所述DNA甲基转移酶至少为两个；

所述DNA甲基转移酶包括Dam和M.SssI。

7.一种同时检测多种DNA甲基转移酶的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)将待测样品和哑铃式探针混合反应后高温终止反应；

2)将步骤1)产物加入环形模板进行滚环扩增反应后高温终止反应；

3)将步骤2)所得RCA产物与信号探针混合进行核酸内切酶IV辅助的信号放大反应并高温终止反应。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用荧光检测系统测定荧光信号，从而实现对DNA甲基转移酶的定量检测。