[发明专利]利用苹果果糖激酶基因提升植物纤维素含量的方法

权利要求书

1.一种苹果果糖激酶基因MdFRK2，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：

ATGGCTAACAATGGCGTACCGCAGACCGGAAAGGGTATGATCGTGAGTTTCGGCGAGATGCTGATCGACTTCGTCCCCACCGAATCGGGCGTTTCTCTTGCCGAAGCTCCTGGCTTCCTCAAAGCCCCAGGCGGGGCCCCCGCCAACGTGGCGATCGCCGTGGCTCGCCTCGGCGGAAAGGCCGCGTTCGTCGGAAAACTCGGCGACGACGAGTTCGGCCACATGCTCGCCGGCATCCTGAAGAAATACGGCGTCGCTGGAGAAGGCATCTCGTTCGATCAGGGCGCCCGCACCGCCTTGGCCTTCGTGACCCTACGCGCCGACGGTGAACGTGAGTTCATGTTCTACCGGAACCCTAGCGCCGATATGCTGCTGAAGCCCGACGAGCTCAACATCGAGCTCATCAAATCCGCCAAAGTGTTCCACTATGGATCCATTAGCTTGATCGTGGAGCCGTGCAGATCGGCACATCTGAAGGCAATGGAGGTGGCTAAAGAAGCAGGTGCATTGCTCTCCTACGACCCGAACCTCCGGGAGCCGCTGTGGCCGTCGCGGGAAGAGGCAAAGAAGCAGATAATGAGCATATGGGATAAGGCCGATGTGATCAAGGTGAGTGATGTGGAGCTGGAGTTCCTTACAGGGAGCCCCAAGATTGATGATGCCAATGCCATGACACTGTGGAGAGATAGCTTGAAGCTCCTCCTTGTCACTCTTGGTGAGAAGGGTTGCAGATACTACACCAAGAATTTCCGTGGAGTGGTGGAATCCTTCGAGGTCAAAGCCGTTGACACTACCGGCGCCGGTGATTCGTTTGTCGGTGCTCTCCTTGCGAAGATTGTCGATGACCACTCTATTCTTGAAGACGAGAAGAGGTTGAGGGAGGTACTGAAATTTGCAAATGCATGCGGAGCGATTACAACAACCAAGAAGGGAGCGATCCCCGCACTTCCCAACGAGTCTGAAGCCCTCACCCTCTACAAAGCAAATTAG。

2.一种含有权利要求1所述的苹果果糖激酶基因MdFRK2的重组过量表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组过量表达载体，其特征在于，所述重组过量表达载体将MdFRK2基因通过Gateway方法构建到pGWB401载体中。

4.根据权利要求3所述的重组过量表达载体，其特征在于，所述过表达载体的构建方法为，过表达载体使用Gateway系统的pGWB401载体，分析pGWB401载体的多克隆位点和苹果果糖激酶基因MdFRK2核苷酸序列，设计含有attb位点的扩增引物，以pMD19T-MdFRK2作为模板，进行扩增，扩增体系为50μL；

扩增程序：98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；循环完成后72℃延伸5min，扩增完成后，对目的片段进行纯化回收、连接、阳性克隆的获得和测序；

经过测序的目的基因片段，通过添加attb酶切位点的引物PCR，产生带有attb位点的基因片段；

BP反应：用donor 222载体与attb-PCR产物反应，25℃反应过夜，反应产物转化TOP10感受态大肠杆菌，涂板，挑取阳性克隆；

用M13通用引物检测阳性克隆；

提取质粒，进行LR反应，用401植物表达载体与BP产物反应，25℃温育过夜，反应产物转化TOP10，涂板，挑取阳性克隆；

用attb通用引物PCR检测阳性克隆；

最后应用冻融法将已连好载体pGWB401的MdFRK2导入到农杆菌EHA105中。