[发明专利]用于检测杀菌型乳制品中乳酸乳球菌的引物对和探针及其方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测杀菌型乳制品中乳酸乳球菌的qPCR方法，包括：步骤一：提取杀菌型乳制品的DNA，以杀菌型乳制品的DNA为模板，进行qPCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤二：检测扩增产物的荧光信号；其中，用于qPCR扩增的反应体系中含有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的扩增乳酸乳球菌的特异性引物对和如SEQ ID NO：3所示的乳酸乳球菌的特异性探针。本发明还公开了一种用于检测杀菌型乳制品中乳酸乳球菌的特异性引物对和特异性探针、检测试剂盒及其应用。本发明的qPCR方法，可快速、简便地检测杀菌型乳制品中是否存在乳酸乳球菌以及定量检测杀菌型乳制品中的乳酸乳球菌的含量。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种用于检测杀菌型乳制品中乳酸乳球菌的引物对和探针及其方法和应用。

背景技术

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)归属于硬壁菌门(Firmicutes)杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactoba-cillales)链球菌科(Streptococ-caceae)乳球菌属(Lactococcus)。其细胞呈球形或者卵圆形，在液体培养基中成对或短链生长[张刚.乳酸细菌——基础、技术和应用.第一版.北京:化学工业出版社，2007:60-61]。乳酸乳球菌是发酵工业中常用的发酵剂之一，特别是在发酵乳制品中；一般包括三种Lactococcus lactissubsp.lactis、Lactococcus lactis subsp.cremoris、Lactococcus lactissubsp.Diacetyl；在食品工业中应用广泛，尤其在乳制品的生产发酵过程中发挥了重要作用，是被公认安全的食品级微生物。

2016年在《卫生部公安厅关于印发(卫办监督发[2016]6号)，规范了食品中允许使用的菌种，将乳酸乳球菌列为可使用菌种名单；而在作为检测食品中乳酸菌金标准GB4789.35-2016中，乳酸乳球菌未列入检测范围内，造成了检测上的缺陷。传统检测方法主要是培养法，需要依赖于微生物的分离和培养，通过表型特征鉴定，常会出现假阳性等现象，效果往往不理想[Jensen S.The lactic acid bacteria，Host，Copenhagen,1919:1-196]。而在复合添加菌株比例差异较大的产品，以及近年来市场上涌现出大量的杀菌型益生菌乳制品，是无法通过培养法分离和鉴定的。现今更多的是利用分子生物技术在此类产品中得到应用[Wu YT,Liu XL,Cao Y,et al.Detection of bifidobacteria infermented dairy products by real-time fluorescent quantitative PCR[J].FoodSci,2013,34(8):172–5]。

发明内容

本发明针对现有技术的缺陷，通过生物信息学手段获取可用于鉴定乳酸乳球菌的特异性序列，借助软件对此系列进行比对，设计菌株特异性引物探针。建立检测乳制品中乳酸乳球菌方法，该方法具有良好的特异性、重复性好，灵敏度低，检测快速可靠、操作简单的特点并且结果直观。

因此，本发明的第一个目的是提供一种用于检测杀菌型乳制品中乳酸乳球菌的qPCR方法，可以用于检测乳制品中是否含有乳酸乳球菌。本发明的第二个目的是提供一种用于检测杀菌型乳制品中乳酸乳球菌的检测试剂盒，以使乳制品中乳酸乳球菌成分的检测快速、准确。本发明的第三个目的是提供一种用于检测杀菌型乳制品中乳酸乳球菌的特异性引物对和特异性探针。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种用于检测杀菌型乳制品中乳酸乳球菌的qPCR方法，该方法包括以下步骤：

步骤一：提取杀菌型乳制品的DNA，以杀菌型乳制品的DNA为模板，进行qPCR扩增，获得PCR扩增产物；

步骤二：检测扩增产物的荧光信号；