[发明专利]基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法

说明书

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法，所述方法利用CRISPR‑Cas12b系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3任一所示。本发明检测方法操作简单，检测时间短，对提取好的样品DNA进行检测，仅需在1小时以内即可出检测结果；对于实际样本菌液进行检测，只需要1‑2小时便可出检测结果：特异性强，灵敏度高，适用范围广。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是一种重要的食源性人畜共患病原菌。空肠弯曲菌可以引起人的腹泻、发热等症状，是细菌行胃肠炎的常见致病菌之一。空肠弯曲菌广泛存在于家禽、家畜以及鸟类的肠道内，在很多动物中属于正常携带细菌，能够通过食物链传递给人类，引起人类疾病。世界卫生组织已经将空肠弯曲菌列为最常见的食源性病原菌之一。空肠弯曲菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是必需检测的项目，有重要社会、经济意义。

目前检测空肠弯曲菌采用的方法主要是传统的分离培养法，但由于空肠弯曲菌的培养条件较为苛刻，使得传统的分离培养法存在操作复杂、灵敏度低、特异性不强等弊端。因此，亟需开发一种快速精准的检测空肠弯曲菌的方法来满足现有的不足。

基于Cas12b蛋白开发的CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,Crispr-associated proteins)检测系统，是一种新型检测方法。利用Cas12b蛋白在sgRNA的引导下，识别匹配的目标序列后就会启动无差别的序列切割活性，即sgRNA和目标序列有单碱基的差异就不能激发其切割荧光探针的活性。CRISPR-Cas12b检测系统与传统的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)相比，对靶标的检测达到了单碱基的水平，可用于SNP位点分型，这就赋予了CRISPR-Cas12b更高的特异性。同时CRISPR-Cas12b检测系统不需要繁琐的操作步骤，只需将反应体系于48℃孵育30-35min，65℃灭活5min，将反应体系于485nm的蓝光下观察颜色是否变成绿色即可，整个检测过程可在1-2h左右完成。

目前尚未有关于利用CRISPR-Cas12b检测系统检测空肠弯曲菌报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法，用于解决现有技术中缺乏有效的空肠弯曲菌检测的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供了基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测方法，所述方法利用CRISPR-Cas12b系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。

进一步地，所述CRISPR-Cas12b系统利用Cas12b和sgRNA进行CRISPR检测，所述sgRNA以所述靶标位点为把靶序列进行设计。

所述sgRNA的设计原则为：在选取sgRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。

进一步地，所述sgRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4-6任一或几个所示的序列。

进一步地，所述方法还包括利用报告基因通过荧光显色技术显示检测结果。

进一步地，所述方法具体包括：

(1)体外转录纯化sgRNA；

(2)提取样品基因组DNA；