[发明专利]一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法

说明书

本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明将相应靶基因crRNA及活性Cas3在氧化葡萄糖酸杆菌中进行表达。通过验证对氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的敲除作用，表明本发明的这种敲除方法能够有效敲除氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因，与现有的在氧化葡萄糖酸杆菌中敲除基因的方法相比，操作更加简便、快捷、高效。

技术领域

本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌属于醋酸菌群,是一种专性需氧革兰氏阴性微生物,它们能很好地适应含丰富醇糖的栖息地，如鲜花、水果、发酵食品和饮料。由于其众所周知的不完全氧化能力,这种细菌已经成功地应用于商业生产维生素C前体，二羟基丙酮、葡糖酸、米格列醇等。氧化葡萄糖酸杆菌具有两个空间分离的醇类和碳水化合物代谢系统。一方面，含大量膜结合脱氢酶的周质空间使得不同底物快速不完全氧化并将对应的产物释放到发酵培养基中。另一方面，由于缺乏磷酸果糖激酶和琥珀酸脱氢酶，这种细菌缺失糖酵解途径和完整的三羧酸循环,戊糖磷酸途径(PPP)和Entner-Doudoroff途径(EDP)是氧化葡萄糖酸杆菌中分解糖类的两个重要途径。

作为一种应用广泛的工业菌种，通过基因工程改造提高氧化葡萄糖酸杆菌的性能具有重要意义。在前人的工作中，通过蛋白质组学分析，鉴定出一个强启动子。一系列合适的人工聚(A/T)尾被报道可以提高编码山梨醇脱氢酶的sldhAB基因的mRNA丰度。将氧化葡萄糖酸杆菌中隐蔽质粒的par-rep基因插入pUC中，构建了几个穿梭质粒进行基因过表达。分别以5-氟尿嘧啶和蔗糖为反选试剂，建立了两种无标记基因敲除方法。这些研究为氧化葡萄糖酸杆菌的代谢工程做出了贡献。然而，与大肠杆菌、酿酒酵母等模型微生物相比，工业菌株氧化葡萄糖酸杆菌的遗传工具研究相对匮乏。

CRISPR/Cas系统为约46％的细菌和90％的古生菌提供适应性免疫，以抵御质粒和噬菌体等侵入性核酸元件。第2类单Cas核酸酶，如Cas12或Cas9，广泛应用于微生物、动植物等多种生物的基因组修饰。然而，大多数天然CRISPR/Cas系统由多亚基复合物组成，属于第1类。第1类包括I、III和IV型。其中I型系统，包括I-A到I-F加上I-U是最普遍的类型。除了I-F型系统使用Cas2/3作为DNA裂解核酸酶外，其他I型系统使用Cas3来执行此功能。而I型系统的PAM通常位于前间隔序列的5’端。I型系统近年来受到越来越多的关注，基于内源性I型CRISPR/Cas系统的基因敲除系统已在数种微生物中得到开发。到目前为止，还没在氧化葡萄糖酸杆菌中成功开发CRISPR/Cas基因敲除系统的报道。

如果能够在氧化葡萄糖酸杆菌中使用CRISPR/Cas系统来敲除基因，将大大缩短敲除筛选的时间、有效提高基因突变的筛选效率。

发明内容

本发明中，通过CRISPRCasFinder对氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组进行分析，鉴定出一个非常典型的I-E型CRISPR/Cas系统。然后通过分析进一步确定了用于基因敲除的Cas蛋白簇的表达。本发明中，CRISPR/Cas基因敲除系统的开发丰富了氧化葡萄糖酸杆菌的基因编辑工具，促进了用以提高其性能的代谢工程修饰。此外，它可能对其他基因操作工具匮乏菌株的代谢工程改造有启示。

本发明的第一个目的是提供一种敲除氧化葡萄糖酸杆菌基因的工具，所述工具由Cas3蛋白、crRNA、表达crRNA的启动子和表达载体组成；所述Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述crRNA由任意能够在氧化葡萄糖酸杆菌中可以表达的启动子启动；所述Cas3蛋白由氧化葡萄糖酸杆菌自身的启动子启动。

在本发明的一种实施方式中，crRNA由目的基因的spacer序列和其两端的重复序列组成。

在本发明的一种实施方式中，所述表达crRNA的启动子包括启动子p_Atse，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。