[发明专利]一种石斑鱼精巢人工催熟的方法

权利要求书

1.一种石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建Dmrt1基因真核表达载体：通过克隆获得斜带石斑鱼Dmrt1开放读码框，通过双酶切和连接将基因构入真核表达载体，转化到大肠杆菌中扩大培养，提取获得大量带dmrt1基因的真核表达载体；

脂质体包埋真核表达载体：采用脂质体包埋构建好的Dmrt1真核表达载体；

选择石斑鱼：在繁殖季节选择不能产生精液的雄性石斑鱼；

注射脂质体包埋的Dmrt1真核表达载体：在石斑鱼腹部开微孔，采用微量注射器将脂质体包埋的Dmrt1真核表达载体直接注射入精巢；

注射完成后的饲养：注射完放入水泥池饲养，按时投喂高蛋白饵料。

2.如权利要求1所述的石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，构建Dmrt1基因真核表达载体步骤中，以斜带石斑鱼精巢总mRNA为模板，以RNA Oligo dT为引物，反转录得到cDNA，再以所述cDNA为模板，通过PCR扩增引物进行PCR扩增，获得斜带石斑鱼Dmrt1开放读码框。

3.如权利要求2所述的石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，所述PCR扩增引物其上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

4.如权利要求1所述的石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，构建Dmrt1基因真核表达载体步骤中，采用EcoRⅠ和Kpn l两种中内切酶进行双酶切，采用T4DNA连接酶将切开质粒和片段连接起来，所述真核表达载体采用p3×flag-CMV-13载体。

5.如权利要求1所述的石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，构建Dmrt1基因真核表达载体步骤中，所述转化到大肠杆菌扩大培养是转化到DH5α感受态，挑取单菌落经测序确定表达载体中的外源基因无误后，将单菌落接种至100ml含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃，250rpm振荡过夜培养。

6.如权利要求1所述的石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，选择石斑鱼步骤中，选用手推挤腹部不会有精子流出的雄性石斑鱼。

7.如权利要求1所述的石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，注射脂质体包埋的Dmrt1真核表达载体步骤中，开微孔选生殖孔往前2.0-4.0cm的位置，用手术刀划开一个微孔，划的长度为0.5-0.8cm。

8.如权利要求1所述的石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，注射脂质体包埋的Dmrt1真核表达载体步骤中，注射器针头长度为6-8cm，注射时采用多点注射，每1cm长度性腺注射3ul包埋好的Dmrt1真核表达载。

9.如权利要求1所述的石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，脂质体包埋真核表达载体步骤中，采用脂质体Lipofectamine 3000包埋构建好的Dmrt1真核表达载体。

10.如权利要求1所述的石斑鱼精巢人工催熟的方法，其特征在于，在注射后第五天捞取石斑鱼轻轻推挤腹部检测有没有白色精液流出，如果没有则隔天推挤一次，直到第10天为止。