[发明专利]一种DNA和RNA共建库的方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种DNA和RNA共建库的方法及试剂盒，涉及生物技术领域。所述方法，包括以下步骤：1)RNA片段化及DNA的变性；2)一链cDNA的合成及链置换反应；3)DNA 3'接头连接；4)文库扩增。所述试剂盒包含：工具酶、工具酶反应体系、接头体系、PCR反应体系以及Low‑EDTA‑TE。本发明实现对DNA/RNA样本同时完成测序的建库，打破了常规的建库手段，规避了必须DNA和RNA分别建库的繁琐操作，有效的节省成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA和RNA同时构建测序文库的方法。

背景技术

目前针对不同的核酸样本是采用不同的建库策略。普通DNA样本首先经过末端修复及加A，然后进行接头连接，最后通过PCR扩增完成DNA测序文库的构建，耗时3h左右。普通RNA样本首先需要进行Poly(A)的捕获或者核糖体 RNA的去除，然后进行cDNA的合成，最后通过DNA样本建库策略完成RNA 测序文库的构建，耗时8h。宏基因组测序在新病原体的诊断、检测、跟踪及溯源起到关键的作用。传统的建库方式无法真正做到DNA和RNA样本共同建库，目前出现的一种DNA/RNA共建库的方法是：RNA经过oligo-dT引物反转录后， Tn5转座酶随机对RNA/DNA杂合链进行切割，在片段化之后，转座酶会在杂合链两端加上接头，之后进行PCR扩增。此种方法的核心点在于使用Tn5转座酶对RNA/cDNA复合双链和DNA双链进行打断和添加部分接头，该方法虽然可以很大程度上的优化了建库步骤，节省建库时间，但是Tn5转座酶打断建库依然存在着一些不可避免的缺陷：1)Tn5转座酶打断识别具有特异性，其测序的前9个bP有明显的偏好性，即使是突变的Tn5转座酶也无法完全消除bais；2) Tn5建库是酶量依赖型，对DNA的定量要求高，酶和DNA的比例不准确会影响打断；3)对DNA溶液杂质不耐受，会影响打断效果；4)Tn5建库无法适用于降解性的样本或者分子片段较小的核酸。

因此，有必要针对现有技术的缺陷，采用单链建库的原理，提出一种不同与Tn5转座酶建库的DNA/RNA共建库的方法，简化建库流程，减少建库时间，同时也可以解决测序偏好性的问题，并能适应于降解样本和不同分子片段大小的核酸样本的新型高效共建库方法。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明基于单链建库的原理，提出一种DNA和RNA 共建库的方法，以达到有效的简化建库流程，减少建库时间，解决测序偏好性的问题，也能适应于降解样本和不同分子片段大小的核酸样本的目的。

为了达到上述目的，本发明提出一种DNA和RNA共建库的方法，包括以下步骤：

1.对RNA和DNA混合样本进行RNA片段化及DNA变性；

2.基于S1产物，利用随机引物进行DNA的链置换反应，将DNA片段带上5'接头，形成5'TrunctedAdapter-DNA；将RNA逆转录成一链cDNA，带上 5'接头，形成5'TrunctedAdapter-cDNA；

3.使用外切酶对多余的引物进行消化，再利用磁珠对产物进行纯化；

4.对带5'接头的DNA及带有5'接头的一链cDNA的3'末端添加一段多聚寡核苷酸PloyC，得到5'Truncted adapter-DNA-多聚寡核苷酸结构，利用DNA修复酶、DNA聚合酶及DNA连接酶将所述5'TrunctedAdapter-DNA-多聚寡核苷酸的3'末端和P7接头连接；

5.通过PCR文库扩增，得到上机测序文库。

进一步地，所述步骤1中包括对混合样本中的DNA进行片段化。

进一步地，所述随机引物为T5 TrunctedAdapter+N6，所述随机引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。