[发明专利]一种核酸扩增产物定量检测仪器及核酸扩增产物定量检测方法

说明书

本发明提供了一种核酸扩增产物定量检测仪器及核酸扩增产物定量检测方法，包括光学检测模块和检测控制模块，其特征在于：所述检测仪器包括光学检测模块壳体，光学检测模块壳体开设有供PCR扩增管容置的样品孔，光学检测模块壳体在样品孔的两侧开设有与样品孔垂直相交的通光孔，所述光学检测模块壳体两侧面的通光孔内分别设置光源和光电传感器；本发明直接将核酸扩增反应容器(PCR扩增管)用作比色皿，进行核酸扩增产物定量检测，解决肉眼观察核酸染料显色结果不能获得定量检测结果、分光光度计需要转移样液导致检测过程费时费力、容易造成污染和假阳性结果的缺陷，实现核酸扩增产物的快速定量检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种核酸扩增产物定量检测仪器及核酸扩增产物定量检测方法。

背景技术

核酸扩增技术广泛应用于医疗诊断、动植物检疫、食品安全及转基因检测等领域，具有灵敏度高、特异性强等优点，其检测原理是利用酶促反应使目标基因大量扩增，再通过测定扩增产物实现目标物的检测。因此，简便、快速的核酸扩增产物定量测定对开发基于核酸扩增技术快速检测方法具有重要意义。

核酸扩增产物的定量分析方法主要有实时荧光定量法和凝胶成像分析。荧光实时定量法是在DNA扩增反应体系中加入荧光探针，随着扩增反应的进行，扩增产物不断积累，导致荧光信号不断积累，从而利用荧光信号的变化实时监测整个扩增进程。这种方法的缺点是需要价格昂贵的实时荧光定量PCR仪，限制了在实际生产中的应用。利用凝胶成像定量分析核酸扩增产物需要先对扩增产物进行凝胶电泳，然后使用染料进行染色，再用成像系统进行拍照，对照片中被染色的扩增条带亮度进行定量分析，进而得出扩增产物的含量。这种方法的缺点是要经过凝胶电泳、染色、拍照以及对照片的分析等多个步骤，操作费时费力，而且常用的染色试剂溴乙锭(EB)具有致癌性，会对操作人员造成潜在危害，废弃物处理不当还易对周围环境和生物造成危害。因此，开发使用方便、经济、快速的核酸扩增产物定量检测方法具有重要意义。

可视化检测是一种在核酸恒温扩增中常用的扩增产物定性检测方法。其中一种可视化方法的原理是检测核酸扩增反应中生成的副产物焦磷酸，核酸链每扩增延伸一个碱基，会释放出一分子焦磷酸根离子。将焦磷酸根分解为磷酸根离子，再加入磷酸显色试剂，发生显色反应则表明样本为阳性。但是，定量的检测结果才能判断被测物含量是否超出限量标准，肉眼观察不能得出具体的含量，导致应用范围受限。

溶液颜色的深浅与有色成分的浓度有关，根据朗伯比尔定律，溶液中的组分浓度与吸光度成正比。因此，测定核酸染料显色后的吸光度是一种可行的定量检测方法。使用吸光度检测仪器测定样液的吸光度时，需要先将样液转移到比色皿中才能进行检测。但是，核酸扩增产物具有样液体积小、容易造成污染的特殊性，这种方式不能适应核酸扩增产物的检测需求：

(1)操作步骤复杂，效率低下。核酸酸扩增反应体系的样品溶液体积小，必须使用超微量比色皿，但超微量比色皿狭小的腔体导致加样难度增大；其次，狭小的腔体容易产生气泡，加样后需要仔细观察才能防止气泡干扰；此外，比色皿需要清洗后才能再次使用，但微量比色皿狭小的腔体内易残留样液，且清洗难度较大，这些因素都会造成检测效率降低，尤其是在大量样本检测时，难以满足使用需求。

(2)易造成气溶胶污染，导致假阳性检测结果。扩增液中含有大量的被扩增DNA片段，容易形成核酸气溶胶，导致实验室环境中弥漫着含有核酸片段的微小颗粒，这些颗粒会污染样品、实验台面、扩增仪器、移液器、移液器吸头等实验仪环境和仪器，这些因素都会加剧空白样的污染风险，导致不含目标物的样本扩增出阳性条带。此外，核酸气溶胶污染产生之后非常难清除，严重时甚至导致实验室停工。使用常规的比色皿进行检测，检测效率低下，样液长时间暴露于空气中，导致气溶胶污染风险急剧增大：

首先，将扩增液转移到比色皿的过程会增加扩增产物在环境中的暴露时间，废弃的移液吸头上也会有样液残留，更重要地是转移样液的过程需要多次吸取样液，进一步加剧空气和液体表面的摩擦，产生更多的气溶胶，加重气溶胶污染风险。