[发明专利]一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法

说明书

本发明涉及一种基于数字PCR方法，并利用多内参结合序贯概率比检验(SPRT)分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及方法。该试剂盒包含数字PCR酶预混液、用于检测靶基因HER2及内参CEP17及EIF2C1的引物探针混合液、荧光素钠盐溶液和ddH₂O。本发明通过比较两内参基因的表达水平，准确有效的判断HER2基因所在17号染色体是否存在多体、单体、着丝粒扩增等情况。此外，还可以通过SPRT分析完成HER2基因拷贝数变异状态的准确判读，显著提高了检测结果判定的准确性，可以作为HER2基因拷贝数变异初次检测的试剂盒及方法使用，具有其他方法所不可替代的优势。

技术领域

本发明涉及一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法，属于生物医学核酸检测技术领域。

背景技术

人表皮生长因子受体2(HER2)是一种编码具有酪氨酸激酶活性的原癌基因，位于17号染色体上。针对HER2基因拷贝数变异的检测是判断乳腺癌预后和制定有效治疗方案的依据(包括激素治疗和化疗的参考指标)，也是是否可以采取靶向药物治疗的先决条件。目前医院广泛开展的HER2基因拷贝数变异的检测方法主要是免疫组化(IHC)方法和荧光原位杂交(FISH)方法。临床数据表明，IHC方法不能准确地判定HER2基因拷贝数变异的状态，结果常常显示将近50％的样本存在IHC判定为2+的情况，之后必须要使用FISH方法进行复检才能确定HER2基因拷贝数变异的状态。另外，还存在10％左右IHC判定为3+的样本再经过FISH检测后，却显示为HER2基因拷贝数变异为阴性的结果，这样的结果不仅会造成多次重复检测的经济损失，而且耽误了患者使用其他治疗方案进行治疗。同时，当IHC检测结果为0、1+时，也会有将近10％的结果在进行FISH检测时却显示HER2基因拷贝数变异为假阴性的情况。因此，IHC方法在前期HER2基因拷贝数变异状态的初步筛查中并不适宜。FISH检测具有较高的准确性、灵敏度和特异性，其结果在不同实验室间的一致性较高，是目前检测HER2基因拷贝数变异状态的“金标准”。但是FISH存在检测周期长、收费高、受检测者专业知识和实验室条件的限制，只能在具有资质的大医院进行，也造成大量样本不能得到及时的判定而失去个体化用药的机会，作为全方面的初次诊断也不适宜。因此，针对IHC/FISH检测中的各种问题，寻找一种初次使用就能更准确检测HER2基因拷贝数变异状态的方法是非常重要的。数字PCR技术是将一个样本分成几万份，分配到不同的反应单元(微滴)中并在每个微滴中经过PCR扩增得到荧光信号，再通过泊松分布计算出核酸分子的浓度，因此具有更高的灵敏度和准确性，可以直接精准计数得出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。特别适用于拷贝数变异、突变检测、基因相对表达等研究领域。其中南京科维思生物科技股份有限公司的HER2基因扩增检测试剂盒(数字PCR法)是目前市场上唯一使用的数字PCR方法对HER2基因扩增状态进行检测的试剂盒。但是，该试剂盒仅采用了一个内参基因，无法判断17号染色体是否存在多体、单体、着丝粒扩增等情况，从而造成假阳性或假阴性的结果。除此之外，因为数字PCR方法是通过对反应后的微滴进行泊松分布计算才得到的数据结果，所以对于得到微滴数据后的群体统计分析也非常重要，目前使用数字PCR方法检测多内参并结合所得到的HER2基因拷贝数变异的数据进行群体统计分析的试剂盒以及方法还未见有报道。