[发明专利]一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异试剂盒的非诊断目的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）提取待测样本的DNA作为模板，以一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异试剂盒中配置的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物核苷酸序列溶液作为扩增引物，并加入试剂盒中配置的SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示的探针核苷酸序列溶液作为检测探针，并加入试剂盒中配置的数字PCR酶预混液、荧光素钠盐溶液和ddH₂O进行数字PCR扩增，扩增之后对扩增结果进行拷贝数及微滴数统计并将HER2基因的拷贝数简写为H、CEP17基因的拷贝数简写为C、EIF2C1基因的拷贝数简写为EI、HER2基因的阳性微滴数简写为dH、CEP17基因的阳性微滴数简写为dC、扩增的总微滴数简写为dTotal、仅包含HER2的阳性微滴数简写为N_HER2、仅包含CEP17的阳性微滴数简写为N_CEP17、仅包含HER2的阳性微滴占比简写为Pr、HER2扩增的阈值线简写为T、群体样本微滴中的CEP17拷贝数的平均值简写为M_CEP17；所述的N_HER2= dH-dH×dC/dTotal；所述的N_CEP17=dC-dH×dC/dTotal；所述的Pr= N_HER2/（N_HER2+N_CEP17）；所述的T为以dH/dC的比值绘制接受者操作特征曲线的线下与坐标轴围成的面积最大时对应的值；所述的M_CEP17= -Ln（1-dC/dTotal）；

（2）计算每个样本C/EI比值以及群体样本的C/EI的平均值并统计群体样本的C/EI比值的95%的置信区间，若某个样本的C/EI比值处于置信区间内，则判定为HER2基因所在的17号染色体为正常，若某个样本的C/EI比值处于置信区间之外，则判定为HER2基因所在的17号染色体疑似异常；

（3）对所检测的群体样本的HER2基因的拷贝数变异结果进行序贯概率比检验分析：根据（1）中所得到的T及M_CEP17计算在HER2扩增接受备择假设时，仅包含HER2阳性微滴的比例q1，q1=[1-exp（-T-0.05）]×(1–dC/dTotal)/｛1-exp（-T-0.05）×M_CEP17+ dC/dTotal-2[(1-exp（-T-0.05）M_CEP17]×（dC/dTotal）｝；

（4）根据T及M_CEP17计算在无HER2扩增的情况下接受原假设时，仅包含HER2阳性微滴的比例q0，q0=[1-exp(-T+0.05)]×(1–dC/dTotal)/｛[(1-exp(-T+0.05)×M_CEP17]+dC/dTotal–2[1-exp（-T+0.05）M_CEP17]×（dC/dTotal）｝；

（5）由上述两种情况下的仅包含HER2基因阳性微滴的比例，计算得到HER2基因拷贝数变异判定的阈值线：高值=｛（Ln 8）/（N_HER2+N_CEP17）-Ln[（1-q1）/（1-q0）]｝/Ln[q1（1-q0）/q0（1-q1）]；低值=｛（Ln 1/8）/（N_HER2+N_CEP17）-Ln[（1-q1）/（1-q0）]｝/Ln[q1（1-q0）/q0（1-q1）]；

（6）若HER2基因的Pr值高于阈值线高值，则判定HER2基因拷贝数变异状态为阳性；若Pr值低于阈值线低值，则判定HER2基因拷贝数变异状态为阴性；若Pr值介于高值和低值二者之间，则判定HER2基因拷贝数变异状态为不可分类；

（7）若判定HER2基因拷贝数变异状态为不可分类，则通过数字PCR检测增加更多的HER2基因阳性微滴数，直至得到明确的HER2基因拷贝数变异为阳性或阴性的结果；

（8）对于判定为HER2基因所在的17号染色体疑似异常并且通过序贯概率比检验分析后HER2基因拷贝数变异为阴性结果的样本需要再次使用荧光原位杂交的方法进行检测以确定HER2拷贝数变异的真实状态。