[发明专利]一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体

说明书

本发明公开了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体能够将烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸转化为β‑烟酰胺单核苷酸(β‑NMN)。该突变体的半衰期相对于野生型提高幅度高达5.3倍，提升了烟酰胺磷酸核糖转移酶的储存时间和转化效率，更适于工业化生产应用。

技术领域：

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种用于制备β-烟酰胺单核苷酸的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。

背景技术：

烟酰胺单核苷酸也叫β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide Mononucleotide，β-NMN)，结构如化合物Ⅰ所示。

β-烟酰胺单核苷酸在人体细胞能量生成中扮演重要角色，参与细胞内NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，细胞能量转化的重要辅酶)的合成，是NAD⁺的关键前体之一。DavidScinclair研究团队在文献Science,2017,355,1312-1317中报道，NAD⁺在小鼠体内的增加，能够使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被延缓，这项研究工作使得人类向实现长寿梦想迈进了一大步。NAD⁺分子量过大，口服吸收利用率低。但随着对NAD⁺前体小分子物质β-NMN的研究发现，服用β-NMN可以有效提升体内NAD⁺的浓度，并显著改善人体新陈代谢，使得β-NMN成为了“不老神药”。这也促使全球医药、食品、化妆品界科研人员不断的对β-NMN进行研究与开发。

目前，在β-NMN的生物酶法合成中，烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)是最为关键的限速酶，它能催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸发生反应合成β-NMN，转化反应式如Scheme 1所示。

在催化反应中，酶的催化效率和稳定性是工业应用的重要指标，而现有的野生型烟酰胺磷酸核糖转移酶在催化效率和稳定性上都较差，严重制约了β-NMN的生物催化技术的产业化的应用。

因此，提高烟酰胺磷酸核糖转移酶的稳定性是降低β-NMN的生物催化合成成本、提高烟酰胺磷酸核糖转移酶的工业应用价值、促进生物催化技术在β-NMN产业化生产中应用的关键因素。

发明内容：

针对现有技术中烟酰胺磷酸核糖转移酶的稳定性较低、工业应用价值较低的问题，本发明的目的在于提供一种稳定性高于现有野生型的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。

一方面，本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，以SEQ ID NO.1所示的野生型烟酰胺磷酸核糖转移酶的氨基酸序列为参考序列，在314、315、417、419、450、452位点发生单点或者多点突变。其中，第314位的Ser突变为Cys，第315位的Gly突变为Cys，第417位的Pro突变为Cys，第419位的Ala突变为Cys，第450位的Leu突变为Pro，第452位的Glu突变为Pro。

进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13、15所示。

进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16所示。

进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体来源于Homo sapiens，野生型模板NCBI的登录号为NM_005746.3。

进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体表达于大肠杆菌E.coli BL(21)DE3。

进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的表达载体为pET28a。

另一方面，本发明提供了烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的应用，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体可应用在制备烟酰胺单核苷酸的工艺中，催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸转变为烟酰胺单核苷酸。