[发明专利]一种同步检测花毛茛中五种重要病毒病原的方法

说明书

本发明公开了一种同步检测花毛茛中五种重要病毒病原的方法，所述的五种重要病毒病原为花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒和花毛茛叶片皱缩病毒。本发明应用通过提取植物总RNA或病毒RNA、随机引物合成不同种类病毒cDNA第一链、5种病毒特异引物多重复合PCR检测，省略了单一病毒引物逆转录合成cDNA第一链和病毒核苷酸序列测定与分析等步骤，利用多重PCR的快速和灵敏性获得目的片段，为大量、快速、准确、灵敏检测各类花毛茛病毒病样品建立了一种科学的方法。

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，具体涉及一种同步检测花毛茛中重要病毒病原的方法。

背景技术

花毛茛（ Ranunculus asiaticus）为毛茛科（ Ranunculaceae）毛茛属（ Ranunculus Linn）多年生草本花卉，又称芹菜花，波斯毛茛、草牡丹、赛牡丹。其花色丰富，其株形秀丽，花茎挺立；花朵硕大，花型似牡丹花，靓丽多姿；花瓣紧凑、多为重瓣或半重瓣，花色丰富、光洁艳丽。是春季盆栽观赏、布置露地花坛及花境、点缀草坪和用于鲜切花生产的理想花卉。其原产于欧洲东南部和亚洲西南部。1596年英国人引入进行人工栽培，在园林和切花中很常见。荷兰、英国、法国、美国、日本等栽培较多，并且培育出许多切花和盆栽品种。中国在上世纪90年代开始从荷兰、日本等引种，作为切花、盆栽和春季花卉展览用花在各大城市均有栽培和种植。

由于花毛茛品种多数由国外引种栽培，其生产种植过程中病虫害发生情况尚不清楚。初步调查发现在温室育苗过程中真、细菌和病毒病害以及蚜虫、蓟马等害虫均有发生，对于主要通过块茎和组培种苗进行扩繁种植的花卉品种，病毒病是花毛茛种苗生产中最为重要的病害。目前已发现包括马铃薯Y病毒科、雀麦花叶病毒科5种病毒可侵染花毛茛。这些植物病毒病原侵染花毛茛植株后，植株会表现出典型的病毒病症状，包括叶片黄化、畸形，叶片增厚、植株矮化等，严重影响种苗质量及花色及形状。

通过化学药剂、高温及茎尖剥离脱毒技术可以脱除种苗中大部分病毒，该方法被用于马铃薯、果树、花卉等多种无性繁殖的农经作物。随着育苗企业和种植户对花毛茛种苗需求量增长，明确脱毒花毛茛种苗、田间植株以及环境中各种病原重要中间寄主的带毒情况，研究并应用一套准确、简便、灵敏、经济的检测方法用于种苗脱毒筛选和田间病原检测。根据前期对各地花毛茛田间植株、种苗及组培苗等样品的检测，以下5种病毒是目前为害最严重、发生区域较广泛、检出率最为普遍的病毒病原。

花毛茛轻花叶病毒（ Ranunculus mild mosaic virus，RaMMV）、花毛茛叶片皱缩病毒（ Ranunculus leaf distortion virus, RaLDV）和花毛茛花叶病毒（ Ranunculus mosaic virus, RaMV）均属于马铃薯Ｙ病毒科（ Potyviridae）马铃薯Y病毒属（ Potyvirus）成员。其病毒粒子为线状病毒，长度680～900 nm，宽度12～15 nm。病毒粒子为正单链RNA 分子，大约10K bp，编码一个多聚蛋白。该属病毒常引起花叶、皱缩、木质化，分布较广且造成严重经济损失。主要通过蚜虫非持久性非循环传播，此外病毒还可通过嫁接传播或刀具、剪刀类机械传播。