[发明专利]一种同步检测花毛茛中五种重要病毒病原的方法

权利要求书

1.一种同步检测花毛茛中五种重要病毒病原的方法，所述的五种重要病毒病原为花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒和花毛茛叶片皱缩病毒，其特征在于，所述的同步检测花毛茛中五种重要病毒病原的方法包括以下步骤：

提取待测植物样本总RNA或病毒RNA；

设计用于扩增病毒病原花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒、花毛茛叶片皱缩病毒基因片段的特异性引物；

合成cDNA第一链；

利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；

将获得的PCR扩增产物进行1.5-2.0%琼脂糖凝胶电泳检测；

所述的特异性引物为：

花毛茛轻花叶病毒特异引物：

RaMMV-1055F：5′-GATGGAAGGCGAAGAACA-3′；

RaMMV-1634R：5′-AGCGGTCATTATACGATTCA-3′；

花毛茛隐症病毒特异引物：

RaLV-645F：5′-AATCGTTGGCATACACATTC-3′；

RaLV-1364R：5′-CACAGTTCCTTCTTCTTCATC-3′；

花毛茛白斑驳病毒特异引物：

RaWhMV-2876F：5′-AAGACATAAGGCAGTGAAGT-3′；

RaWhMV-3552R：5′-AAGGCAGCAGGAGGTAAT-3′；

花毛茛花叶病毒特异引物：

RaMV-554F：5′-AGATAAGCAGCAACCTAAGT-3′；

RaMV-927R：5′-CCATCAGTCCACCAAGTAG-3′；

花毛茛叶片皱缩病毒特异引物：

RaLDV-1090F：5′-AGAACACTGGCAAGATACG-3′；

RaLDV-1519R：5′-CCTTCCTGGTGAGATGGT-3′；

所述的单管多重PCR扩增反应的反应体系为：50μL，10倍Taq酶缓冲液5μL、10mmol/L浓度的4对种引物各1μL、2.5mmol/LdNTPs3μL、cDNA5μL、Taq酶1μL、灭菌超纯水28μL；

所述的单管多重PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性3-5min；94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30-40个循环；最后72℃延伸10min；

所述的琼脂糖凝胶电泳检测是应用0.5倍TBE缓冲液配置1.5-2.0%琼脂糖凝胶，取5μLPCR反应液，加1μL6倍上样缓冲液，混合均匀后点样。电泳参数为电压6V/cm、电泳时间约为60-80min，溴化乙锭或花青素染色15min，紫外成像仪中观察、记录。