[发明专利]一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法

说明书

一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，所涉及的微生物菌株为木醋杆菌AS1.1812，保藏号为CGMCC No.1.1812。本发明以木醋杆菌AS1.1812为出发菌株，经过活化、种子培养及发酵培养等工序后，在一定条件下分离、纯化制备得到高纯度的壳聚糖。本发明报道的壳聚糖生产方法具有化学品耗量少、工艺环保，成本低、易于推广生产等优点，生产的壳聚糖可广泛应用于食物、医疗、生物环保等领域。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法。

背景技术

壳聚糖是天然多糖中大量存在的唯一碱性氨基多糖，具有生物降解性、生物相容性、无毒性、抑菌、抗癌、降脂及增强免疫等多种生理功能，被广泛应用于食品添加剂、纺织、环保、美容保健、化妆品、抗菌剂、人造组织材料、药物缓释材料、基因转导载体、组织工程载体材料、医疗以及药物开发等众多领域。此外壳聚糖还有增强人体免疫力、清除体内多余脂肪、抑制有害菌、降低血脂、调节血糖、无毒性抗癌效果及作为生物医用材料等功能。研究表明，壳聚糖可吸附镉、汞、铜等重金属，可作为絮凝各种胶态等颗粒而用于果汁澄清、蔗糖净化、废水处理、蛋白质菌丝体的絮凝等。另外，由于壳聚糖具有生物功能性、安全无毒、可生物降解和生物相容性等优点，在医学上具有较好的应用前景。在农业上，壳聚糖是一种很有效的化肥和农药的载体，能减少农用化肥对环境的污染，有效地保护环境和维持生态平衡。壳聚糖作为自然界仅次于纤维素的第二大丰富的生物聚合物，具有巨大的潜在市场和广阔的应用前景。

传统生产壳聚糖主要有两个方法：虾蟹壳提取法和微生物发酵法。虾蟹壳提取法采用虾蟹等海洋节肢动物的甲壳、昆虫的甲壳、软体动物的壳和骨骼提取甲壳素，再经过强碱溶液脱乙酰获得壳聚糖。这种工艺消耗大量的强酸、强碱，存在较大的环保压力。微生物发酵法相比虾蟹壳提取法具有产品品质稳定，差异小，灰分含量较低，提取过程中需要消耗的酸液少等优点。目前，文献报道较多的微生物发酵法制备壳聚糖的菌种主要为丝状真菌，但其提取方法主要借鉴虾蟹壳法，为去除菌丝体中的蛋白质，同样会产生较多的碱废液，环境不够友好。

木醋杆菌属于微生物发酵和食品生物技术领域长期使用的安全菌株，无毒无害，已经成功应用于细菌纤维素的发酵生产。如中国专利CN106244646A提供了一种血液吸附用细菌纤维素的制备方法，其通过将培养后的木醋杆菌种子液接种于改良的SH的培养基中，静置培养后得到细菌纤维素湿膜，进一步水洗后用氢氧化钠溶液煮沸4小时，水洗后于室温下在0.5%乙酸中浸泡半小时，用蒸馏水冲洗干净，烘干得到细菌纤维素。细菌纤维素是由葡萄糖单体以β-1,4 糖苷键连接而成的直链多糖，壳聚糖是由氨基葡萄糖单体以β-1,4 糖苷键连接而成的直链多糖，虽然壳聚糖和细菌纤维素的化学结构非常接近，但能否利用木醋杆菌生物合成壳聚糖，尚未有明确的报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，所述细菌为木醋杆菌AS1.1812，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC编号为1.1812，包括以下步骤：

S1：将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，所述活化培养基pH 值为6.6~7.0，置于培养箱内倒置活化培养，得到活化的单菌落；

S2：将步骤S1得到的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养至种子液的OD600 达到0.6~1.0后，再将种子液接入发酵培养基中，置于摇床震荡发酵培养，得到发酵后产物；

S3：将步骤S2得到的发酵后产物进行离心分离，收集上层清液，清液中加入氢氧化钠调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；

S4：将步骤S3获得的壳聚糖粗品，使用0.5%乙酸溶液将其充分溶解，离心，收集上清液，清液中加入氢氧化钠溶液调节pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。

其中，所述发酵培养基的制备方法为：