[发明专利]一种定量DNA甲基化程度的电化学方法及系统

说明书

本发明公开了一种定量DNA甲基化程度的电化学方法及系统，通过使用电化学工作站测试样本DNA的电流吸附率，可以很好地反应出样本DNA的甲基化程度，并基于该结果进一步确定样本的肿瘤风险。本发明一些实例的检测方法，具有：1)高灵敏度，最少只需要200μL的血浆样本就足以进行检测；2)无需对DNA进行预处理；3)检测时间短，10分钟左右即可完成检测；4)检测费用低，除DNA提取外检测成本低于1元；有望开发为即时检测的检测技术。

技术领域

本发明涉及一种DNA甲基化程度的定量方法，特别涉及一种定量cfDNA甲基化程度的电化学方法及系统。

背景技术

DNA甲基化是最早发现的基因修饰之一，广泛存在于各物种中，是一种重要的遗传外修饰，是静观遗传学的重要组成部分，参与了动物胚胎发育、基因印迹和X染色体失活等过程，在基因表达的调控中具有重要作用，异常甲基化可以导致肿瘤的形成。对DNA甲基化程度进行检测，具有非常重要意义。

已有的DNA甲基化方法有有机小分子检测法、生物分析方法，(参见赖涵,翁小成.DNA甲基化检测研究进展[J].2012.)。实际使用的cfDNA甲基化检测技术大部分基于PCR技术，包括甲基化荧光定量PCR、甲基化数字滴度PCR和甲基化二代测序。这些技术存在的缺点为：1)需要DNA预处理。进行检测前需要进行DNA预处理，如亚硫酸盐转化和PCR扩增；2)费用较为昂贵。目前的甲基化荧光定量PCR检测一次费用大概为500-1000元，甲基化数字滴度PCR单次检测光耗材成本50美元，甲基化二代测序的费用更为昂贵；3)检测时间较长。甲基化荧光定量PCR通常需要2个小时(不包括DNA预处理)。甲基化数字滴度PCR通常需要4～6小时(不包括DNA预处理)。甲基化二代测序需要的时间更长，通常大于3天；4)样本需求量大。三种检测方式需要1ml甚至更多的血浆样本。

DNA电化学分析方法拥有诸多优势，如检测时间短、操作简单、费用低、易于小型化，且能够可以与其他技术如光化学联用，形成可视化的即时检测方法。日前已经有多篇文献报道应用于DNA甲基化水平和甲基化转移酶活性的分析。根据分析原理不同，主要分为：DNA甲基化的直接电化学分析、间接电化学分析、电致化学发光分析及光电化学分析(参见杨引,樊梦醒,郭智慧,等.DNA甲基化电化学分析[J].化学进展,2014,026(012):1977-1986.)。现有的电化学法DNA甲基化检测技术存在以下缺点：1)需要进行识别层的修饰，例如探针、受体等；2)需要进行DNA的预处理，包括亚硫酸盐转化和PCR扩增；3)由于需要DNA的预处理，因此整体检测时间较长，降低了检测的整体效率。

液体活检技术在恶性肿瘤临床中主要用于恶性肿瘤的诊断、疗效监测、药物筛选和预后评估。相对于组织检测，液体活检具有无创、可重复、持续检测等诸多优势。相对于传统的肿瘤标记物，液体活检技术具有更高的灵敏性以及特异性。

cfDNA是人体细胞包括肿瘤细胞释放到外周循环系统的游离DNA片段，也存在甲基化修饰，且甲基化的程度可以反应肿瘤的状况。对于cfDNA中肿瘤来源的DNA片段进行检测是目前恶性肿瘤液体活检的重要组成部分。

开发出一种免标记、快捷、低成本的DNA甲基化程度检测方法，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种免标记的DNA甲基化检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种DNA甲基化的电化学检测方法，包括：

S1)获取待测DNA样本；

S2)将待测DNA样本溶解于水性缓冲液中，得到DNA溶液；优选的，所述水性缓冲液为TE缓冲液，更佳为pH＝8.0的TE缓冲液；