[发明专利]CRISPR/Cas9系统及其在构建抗肌萎缩蛋白基因缺陷的猪源重组细胞中的应用

权利要求书

1.sgRNA组合，由sgRNA_DMD-Ug3和sgRNA_DMD-Dg3组成；

所述sgRNA_DMD-Ug3的靶序列结合区如SEQ ID NO：8中第1-20位核苷酸所示；

所述sgRNA_DMD-Dg3的靶序列结合区如SEQ ID NO：11中第1-20位核苷酸所示。

2.质粒组合，由质粒pKG-U6gRNA（DMD-Ug3）和质粒pKG-U6gRNA（DMD-Dg3）组成；

所述质粒pKG-U6gRNA（DMD-Ug3）是借助限制性内切酶BbsI将sgRNA_DMD-Ug3的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的；

所述质粒pKG-U6gRNA（DMD-Dg3）是借助限制性内切酶BbsI将sgRNA_DMD-Dg3的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的；

所述sgRNA_DMD-Ug3的靶序列结合区如SEQ ID NO：8中第1-20位核苷酸所示；

所述sgRNA_DMD-Dg3的靶序列结合区如SEQ ID NO：11中第1-20位核苷酸所示；

所述质粒pKG-U6gRNA如SEQ ID NO：3所示。

3.一种试剂盒，包括权利要求1所述的sgRNA组合或权利要求2所述的质粒组合；所述试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）制备重组细胞；（b）制备杜氏肌营养不良症动物模型。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括质粒pKG-GE3；所述质粒pKG-GE3如SEQ ID NO：2所示。

5.权利要求1所述sgRNA组合或权利要求2所述质粒组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）制备重组细胞；（b）制备杜氏肌营养不良症动物模型。

6.权利要求2所述质粒组合和权利要求4中所述的质粒pKG-GE3在共同制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）制备重组细胞；（b）制备杜氏肌营养不良症动物模型。

7.权利要求1所述sgRNA组合或权利要求2所述质粒组合或权利要求3所述试剂盒或权利要求4所述试剂盒的应用，所述应用为如下（a）或（b）：（a）制备重组细胞；（b）制备杜氏肌营养不良症动物模型。

8.一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将权利要求2中所述的质粒pKG-U6gRNA（DMD-Ug3）、权利要求2中所述的质粒pKG-U6gRNA（DMD-Dg3）和权利要求4中所述的质粒pKG-GE3共转染猪细胞，得到抗肌萎缩蛋白基因发生突变的重组细胞。

9.权利要求8所述方法制备得到的重组细胞。

10.权利要求9所述重组细胞在制备杜氏肌营养不良症动物模型中的应用。