[发明专利]竹节参EST-SSR引物组的开发及其在遗传多样性等方面的应用

说明书

本发明公开了竹节参EST‑SSR引物组的开发及其在竹节参遗传多样性中的应用，其应用操作方法步骤如下：S1：材料选择；S2：仪器和试剂选择；S3：DNA提取；S4：进行EST‑SSR引物合成；步骤一：序列来源；步骤二：EST‑SSR位点查找；步骤三：EST‑SSR引物设计；步骤四：EST‑SSR引物筛选；步骤五：聚丙烯酰氨凝胶电泳；在最适退火温度下，对有目标条带的引物用于15份不同产地竹节参材料进行PCR扩增；S5：数据处理；SSR结果分析可知，贵州和云南产地竹节参亲缘关系较近，与四川产地竹节参亲缘关系相对较远，此外，由于不同产地竹节参基本可以彼此单独聚类在一起，因此，本应用可以很好地运用到竹节参的遗传多样性分析、指纹图谱构建以及竹节参道地性的分子鉴定等方面。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体是一种竹节参EST-SSR引物组的开发及其在 遗传多样性等方面的应用。

背景技术

竹节参(Panax japonicus C.A.Mey.)又名竹节三七、竹节人参、白三七等， 为五加科人参属多年生植物，主要分布于陕西、甘肃、安徽、浙江、江西、福建、 河南、湖南、湖北、广西、西藏等地，兼具北药人参和南药三七的功效，既补气 又补血，被民间誉为“草药之王”，以根茎入药，具有散瘀止血，消肿止痛，祛 痰止咳，补虚强壮的功效，提高机体免疫力，延缓衰老，并具有护肝、抗炎、抗 疲劳、抗肿瘤等疗效。

竹节参主要含有丰富的皂苷类成分，如人参皂苷、竹节参皂苷、伪人参皂苷、 竹节人参皂苷甲酯、珠子参苷等。其中皂苷类成分主要为齐墩果烷型三萜皂苷， 如人参皂苷有Rg1、Re、Rg2、Rb1、Rb2、Rd等；竹节参皂苷有Ⅳ、竹节参皂苷 Ⅳa、竹节参皂苷Ⅴ、竹节参皂苷Ⅴ甲酯、Pjs-1、Pjs-2等；伪人参皂甙有F11， 除此之外，还含有丰富的竹节参多糖、氨基酸，少量的挥发油及无机元素等成分。 由于诸多因素，野生竹节参的资源逐年减少，目前已处于濒危状态，目前只有湖 北恩施及周边有栽培。

SSR标记是近几年来发展起来的建立在PCR基础上的第2代分子标记，具有 多态性高、重复性好、共显性遗传、技术简单、特异性强等优点。其具有RFLP 的所有遗传学优点，且避免了RFLP技术中使用放射性同位素的缺点，又比RAPD 的重复性和稳定性高，因而目前已成为遗传标记中的热点。目前，SSR分子标记 广泛应用于中药材的遗传多样性分析、指纹图谱构建和分子鉴定等，如周荣荣等 开发出5对多态性较强、扩增带型稳定的SSR引物，对江西产区9个不同粉葛 栽培种进行遗传多样性分析，为江西粉葛种质建立了DNA身份证，为粉葛的优 良种质选育提供参考信息，为中药材道地性研究提供理论依据。蒋超等开发出13对EST-SSR引物在52份金银花类药用植物中具有有效扩增产物,且引物 jp.ssr4、jp.ssr64及jp.ssr65可用于忍冬及其变种、山银花原植物的鉴别。 郝广婧等开发出了一批为黑果枸杞SSR引物，可用于品种鉴定、遗传多样性及 分子标记辅助育种等方面。在竹节参分子研究方面，程扬等开发了30对SSR 引物，多态性较好，表明SSR分子标记可用于竹节参的品种鉴定；陈镜安等利用 ITS2用于鉴定竹节参及其近缘物种和混伪品；Amit等对竹节参进行了RNA-seq 转录组分析，并与其它人参属植物比较，鉴定出潜在的皂苷生物合成有关的基因。

目前开发EST-SSR引物用于竹节参遗传多样性分析、指纹图谱构建的文章还 少见于报道，本研究通过开发EST-SSRSSR引物对我国不同产地竹节参的遗传多 样性和指纹图谱的构建进行相关研究，这对竹节参野生资源的保护具有重要意义， 也可为竹节参育种和遗传改良奠定基础；其次，构建不同产地竹节参的指纹图谱 (尤其是道地性药材)，为道地性竹节参真伪鉴别提供分子依据。

发明内容

本发明的目的在于提供竹节参EST-SSR引物组的开发及其在遗传多样性等 方面的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：