[发明专利]一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

说明书

本发明涉及生物转化技术领域，具体涉及一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。本发明的方法是以黄芪甲苷为底物，利用木糖苷酶和葡萄糖苷酶双酶复合后，经过一步水解断裂底物C₃位置的木糖苷键和C₆位置的葡萄糖苷键得到环黄芪醇的方法。本发明得到的环黄芪醇的纯度能够达到98％以上，并且该方法操作简单，无污染，反应温度更温和，酶转化机理明确以及酶的底物适应性更宽，适合工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。

背景技术

黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分，环黄芪醇(CA)为黄芪甲苷的苷元。环黄芪醇能够通过激活端粒酶来延长端粒，从而达到抵抗衰老，提高细胞增殖能力的效果。

环黄芪醇的化学式为C₃₀H₅₀O₅、相对分子质量为490.71，是一种无色针状结晶，易溶于甲醇、正丁醇等。天然植物中环黄芪醇的含量极少，因此环黄芪醇的生产主要是通过水解黄芪甲苷C₃位置的木糖苷键和C₆位置的葡萄糖苷键实现。

目前制备环黄芪醇的方法有多种，但是都存在一定的缺陷。如：化学法水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，由于环黄芪醇的三元环结构易在化学法的极端条件下开环，形成副产物黄芪醇，因此，即使通过氧化还原的方法避免了副产物的产生，但是操作步骤极其繁琐，且氧化剂和还原剂的使用增加了生产成本，无法实现规模生产；此方法制备环黄芪醇时还产生大量的废水，造成环境污染。水解酶复合的形式水解黄芪甲苷制备环黄芪醇，由于过程中涉及的酶的种类多，水解活性以及专一性差，酶作用机制也不明确。酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，由于酶的反应条件相差巨大，不能在同一体系中实现黄芪甲苷的转化，操作步骤繁琐，且分离纯化步骤较复杂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，解决了现有环黄芪醇制备方法中污染环境、步骤繁琐、能耗高、酶底物耐受性低、酶作用机理不明确、酶效率低，分离纯化效率低等不足。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，包括如下步骤：

(1)将木糖苷酶Xyl-G9和葡萄糖苷酶Bgcm混合得到复合酶；

(2)将黄芪甲苷和复合酶混合后调节pH，得到反应体系，进行转化反应，生成环黄芪醇。

作为优选，所述木糖苷酶Xyl-G9和葡萄糖苷酶Bgcm的质量比为1.5～2.5:0.5～1.5。

作为优选，所述木糖苷酶Xyl-G9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为优选，所述木糖苷酶Xyl-G9的制备方法为：

(1)将重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9进行培养，得到培养的重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9；

(2)诱导培养的重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9进行产酶发酵；

(3)离心取上清得到木糖苷酶Xyl-G9。

作为优选，所述葡萄糖苷酶Bgcm的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为优选，所述葡萄糖苷酶Bgcm的制备方法为：

(1)将重组大肠杆菌BL21-Bgcm进行培养，得到培养的重组大肠杆菌BL21-Bgcm；

(2)诱导培养的重组大肠杆菌BL21-Bgcm进行产酶发酵；