[发明专利]一种高效液相色谱法检测苹果果肉细胞壁单糖的方法

说明书

本发明公开了一种高效液相色谱法检测苹果果肉细胞壁单糖的方法，该方法首先对苹果果肉细胞壁多糖进行提取，采用酸水解，然后进入酶解步骤，单糖衍生步骤，以及最后将样品瓶中的样品送入高效液相色谱检测步骤。利用本发明方法得到的单糖在衍生前可在短期内保存，比气相色谱法的时间要求更实用，测定相对更准确。应用本发明中的优化方法可以检测苹果果肉细胞壁单糖。采用本发明检测方法中的苹果样品只有水解过程，水解完全后样品中单糖衍生物相对气相色谱法更稳定更准确，其次使用HPLC法用于单糖组成分析时具有分离速度快、分辨率高、重现性好等优点，采用本发明检测方法苹果果肉细胞壁单糖可以直接使用HPLC法结合通用型检测器进行分析。

技术领域

本发明属于苹果果肉细胞壁单糖的检测方法，具体的说是涉及一种采用高效液相色谱法检测苹果果肉细胞壁单糖的方法。

背景技术

现有技术中多糖的单糖组成测定方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、高效毛细管电泳法和高效液相色谱法(HPLC)。薄层色谱法具有操作方便、设备简单、无需衍生化的特点，但是其灵敏度低，分离效果差，仅适用于简单多糖的定性分析。气相色谱法分离效能高、测定快速、灵敏度高，但是糖类化合物和多元醇的挥发性和热稳定性较低、沸点高，需对其衍生化后才能用气相色谱法进行分析，而气相色谱法的单糖衍生物反应操作十分复杂，容易产生异构体，也容易受样品杂质的干扰，误差较大。高效阴离子交换色谱安培检测法是糖类技术分析较为理想的方法，它利用糖类化合物的电化学活泼性，单糖可在强碱溶液中呈离子化状态，因此可以使用强碱溶液作为流动相通过阴离子交换从而达到分离效果。但是通用型示差折光检测器灵敏度低，检测限也较高，而另一种通用型检测器蒸发光散射检测器的价格昂贵且检测步骤繁琐。

单糖分子本身就缺少发色基团，无法直接使用紫外或荧光检测器，因此一定程度上限制了单糖的分析检测。有研究将多糖水解后的单糖用发光试剂衍生后再利用HPLC法分离和检测[13-17]，其原理是1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-menthy-5-pyrazolone，PMP)可以在碱性条件下与单糖定量缩合成PMP-单糖衍生物，该物质较为稳定并在波长250nm处有较强的光吸收[18-20]，这使得紫外检测器可以应用于单糖的分析。其中柱前高效液相色谱法由于其方法快捷、准确、简便而得到广泛应用，已在各种多糖的单糖组成分析中得到应用，但是现有技术中常规酸水解的柱前衍生化法的高效液相色谱法无法应用在苹果果肉中。基于现有技术中存在的上述缺陷，现亟需设计出一种高效液相色谱法检测苹果果肉细胞壁单糖的方法，用于检测苹果果肉细胞壁单糖。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种高效液相色谱法检测苹果果肉细胞壁单糖的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明公开了一种高效液相色谱法检测苹果果肉细胞壁单糖的方法，该方法具体包括如下步骤：

(1)首先对苹果果肉细胞壁多糖进行提取：酸水解：称取苹果果肉多糖AIR样品各10mg，一组三个重复，共3组，放入玻璃管中，加入3ml 2mol/L的三氟乙酸，冲入氮气封口，在恒温水浴摇床中70～90℃震荡65h～75h，然后取出，调节PH值；

(2)然后进入酶解步骤，酶解步骤是本发明方法的特色，向溶液中加入25ul VL9逆转录酶，将溶液加热至45℃～55℃，在震荡机中震荡20h～26h，经过震荡后取出煮沸12min～20min；

(3)单糖衍生步骤：取步骤(2)中得到的液体100ul，向液体中加入氢氧化钠100ul，然后再加入200ul 0.6mol/L的PMP，混合均匀，将混合液在65℃～75℃温度下水浴90min～110min，取出避光放置8Min～12Min，然后加100ul盐酸，混匀；再加氯仿萃取2～3次，取上清液过膜，放入样品瓶中；

(4)将样品瓶中的样品送入高效液相色谱检测步骤：高效液相色谱的检测条件为：采用流动相磷酸盐缓冲液，ph为6.85，用乙腈梯度洗脱，将高效液相色谱仪的柱温设置为30℃～40℃。