[发明专利]一种用于鉴定三平正并殖吸虫囊蚴的试剂盒及使用方法

说明书

本发明提供了一种用于鉴定三平正并殖吸虫囊蚴的试剂盒，含有扩增三平正并殖吸虫囊蚴DNA的上游引物，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，含有扩增三平正并殖吸虫囊蚴DNA的下游引物，其基因序列如SEQ ID NO.2所示，含有鉴定三平正并殖吸虫囊蚴DNA的探针，其基因序列如SEQ ID NO.3所示，在探针的5’端标记荧光基团CY、在3’端标记荧光淬灭基团BHQ2。本发明还提供了上述试剂盒的使用方法。本发明的方法具有很好的特异性；重复性实验表明，本发明提供的检测体系具有很好的稳定性，其检测结果变异较小，控制在统计学范围之内。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种检测寄生虫的试剂盒和方法，具体来说是一种用于鉴定三平正并殖吸虫囊蚴的试剂盒及使用方法。

背景技术

三平正并殖吸虫（Euparagonimuscenocopiosus）主要分布在我国的粤、闽、赣、皖、浙等省的山区。其生活史的第一中间宿主为川卷螺，第二中间宿主为华溪蟹等淡水蟹。三平正并殖吸虫的囊蚴主要定居在蟹的心脏内，个别可以在胸肌、足肌或甚至背壳内软组织里。在报道动物实验中，三平正并殖吸虫可在大鼠和小鼠体内快速发育成童虫并引起肺部出血；三平正并殖吸虫虽可感染实验犬，但虫体成熟所需的时间较长，一般要在三个月以上，且获虫数少;在犬体内虫体的移行或定居部位为腹腔、胸腔、肺的表面或表层下的囊肿，囊肿内可有1~2条成虫。三平正并殖吸虫也可以感染人体。

由于在三平正并殖吸虫的囊蚴与卫氏并殖吸虫囊蚴、斯氏并殖吸虫的囊蚴均寄生在淡水蟹中，且在并殖吸虫病流行的疫区，有中间宿主淡水蟹同时混合感染卫氏并殖吸虫囊蚴和三平正并殖吸虫囊蚴的报道，这就给三种并殖吸虫的囊蚴形态学鉴定带来了一定的困难。虽然在三平正并殖吸虫的鉴定中也有学者采用常规分子生物学的方法，如PCR等方法，但大多是以成虫为样本进行的研究，成虫需要动物模型才能获取，试验过程耗材耗力且成虫的回收率很低。又因常规的分子检测方法耗时长、检测仪器昂贵、对人员要求高，且需要通过相关技能培训并获得上岗证才能进行鉴定等，满足不了现场即时、快速的检测要求。

实时荧光PCR 技术是具有巨大发展潜力的作为当今的高新检测技术。与常规PCR相比，它具有耗时短、特异性强、有效解决PCR 污染问自动化程度高等特点，而且解决了动物模型的感染过程，利用检测中间宿主体内的囊蚴，为水产品的食品检验提供了新的方法。

由于目前三平正并殖吸虫成虫样本难以获取，而但中间宿主溪蟹较易采集。本研究建立一种针对三平正并殖吸虫中间宿主溪蟹中囊蚴的及时、快速荧光定量PCR检测方法，开辟了三平正并殖吸虫囊蚴检测的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴定三平正并殖吸虫囊蚴的试剂盒及使用方法，所述的这种用于鉴定三平正并殖吸虫囊蚴的试剂盒及使用方法要解决现有技术中的鉴定三平正并殖吸虫囊蚴的方法特异性和灵敏性不高的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于鉴定三平正并殖吸虫囊蚴的试剂盒，

含有扩增三平正并殖吸虫囊蚴DNA的上游引物，其基因序列如SEQ ID NO .1所示，

含有扩增三平正并殖吸虫囊蚴DNA的下游引物，其基因序列如SEQ ID NO .2所示，

含有鉴定三平正并殖吸虫囊蚴DNA的探针，其基因序列如SEQ ID NO .3所示，在探针的5’端标记荧光基团CY、在3’端标记荧光淬灭基团BHQ2。

进一步的，还含有和三平正并殖吸虫的线粒体COX1基因对应一致的一个标准阳性对照质粒DNA模板，以及进行实时定量PCR检测所需要的试剂，所述的三平正并殖吸虫的线粒体COX1基因的序列如SEQ ID NO .4所示。