[发明专利]用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法

说明书

本发明公开了一种用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法，涉及基因工程和基因遗传修饰技术领域。本发明公开的打靶载体包括第一表达盒和位于第一表达盒下游的第二表达盒，第一表达盒具有依次串联的如下元件：肝脏特异性启动子、四环素转录激活调控因子以及第一polyA；第二表达盒具有依次串联的如下元件：第二polyA、小鼠尿激酶原激活剂编码基因以及四环素诱导型启动子。该打靶载体所构建的肝损伤小鼠模型具有自发肝损伤以及经诱导加重肝损伤的表型，其杂交后代的小鼠死亡率低，便于大规模的繁育；本发明为肝脏疾病的研究提供了可靠的肝损伤小鼠模型。

技术领域

本发明涉及基因工程和基因遗传修饰技术领域，具体而言，涉及一种用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法。

背景技术

肝脏疾病是威胁人类健康最严重的疾病之一，尤其是乙肝(HBV)、丙肝(HCV)、肝硬化、肝癌、非酒精脂肪肝(NAFLD)、酒精性肝病(ALD)和药物性肝损伤(DILI)，其中以病毒性肝炎最为广泛。病毒性肝炎具有嗜肝性，具有较强的种属特异性和组织特异性。如乙肝病毒和丙肝病毒的自然宿主仅限于人类和少数非人灵长类动物（黑猩猩），并且只感染宿主的肝脏组织。但使用黑猩猩进行病毒性肝炎的研究在伦理和经济上都受到限制。由于人类肝脏疾病的复杂性及缺乏合适的动物模型，限制了人类肝脏重大疾病的医学研究及转化。肝脏人源化小鼠模型由于嵌合了人肝细胞，可以模拟人类感染肝炎病毒的过程，从而使肝脏疾病的研究更加深入。

在药物研发中，通过临床前动物实验和人体实验的PK/PD来判断药物是否安全，对药物临床试验成功与否具有指导意义。但很多药物代谢酶具有物种特异性，而大鼠或小鼠的肝脏代谢功能与人的肝脏代谢功能不同，使用大鼠或小鼠进行药物PK/PD测试，不能真实地反应药物在人体内的代谢情况，因此有可能导致该药物在人体上的极大的安全性风险。为了阐明人体中的药物代谢途径，需人肝细胞进行试验。与体外人肝细胞代谢实验相比，肝脏人源化小鼠更能真实地反映药物在人体内的代谢途径。

肝脏人源化小鼠构建的基础是必须有肝损伤的小鼠作为受体，接受人源肝细胞的植入，人肝细胞在小鼠体内增殖发育为具有功能的人鼠嵌合肝脏。目前，常用的肝损伤模型包括uPA-SCID、Fah–/–Rag2–/–Il2rg–/–(FRG)、TK-NOG以及Alb-uPA等。尽管已报道在这些模型的人肝嵌合率可达到90%，但这些模型仍然存在一些缺陷，限制了其应用。例如uPA-SCID、Alb-uPA和FRG模型由于肝毒性造成子代小鼠在围产期频繁死亡，导致新生小鼠的死亡率非常高，难以大规模的繁育。TK-NOG模型小鼠雄性不育，使模型难以繁育传代，限制了模型的使用；uPA-SCID小鼠进行重建后，人肝细胞(h-heps)置换指数因同源重组缺失uPA基因而降低，且容易发生肾脏疾病。邓宏魁利用携带不同载体片段的小鼠联合带有uPA基因的腺病毒转染或者通过携带不同载体的两个模型配繁（但繁育过程相当繁琐），在小鼠体内实现了Tet on-uPA重组系统，在理论上，可控的uPA表达时机，改善了小鼠死亡。然而，由于维持uPA表达需要反复进行腺病毒感染，宿主小鼠易产生抗性，影响后续腺病毒感染率，降低了uPA的表达，导致肝细胞重建效率降低。此外，该模型注射腺病毒后可激活天然免疫，影响了对肝炎病毒激发免疫反应的观察，不适合用于肝炎病毒的感染研究。

由于以上限制，本领域非常需要一种合适的肝损伤小鼠模型进行人源化肝脏的构建，以及使用人源化肝脏小鼠模型进行后续的肝脏疾病研究和药物筛选。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的包括但不限于提供一种用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法。使用本发明提供的打靶载体所构建的肝损伤小鼠模型不需要使用诱导物诱导即可形成肝损伤，其可以自发形成肝损伤，使用诱导物可以加强肝损伤的程度，此外，该肝损伤小鼠模型的自发肝损伤程度即能够满足外源肝细胞的移植要求，且肝细胞移植后的重建率也较高；另外，该肝损伤小鼠模型可以通过杂交繁育后代肝损伤小鼠，后代小鼠的死亡率低，便于大规模的繁育；本发明为肝脏疾病的研究提供了可靠的肝损伤小鼠模型。