[发明专利]一种研究鸡生殖细胞自噬的方法

说明书

一种研究鸡生殖细胞自噬的方法，属于生物技术领域。在生殖细胞中添加雷帕霉素激活细胞自噬，转染不同MOI值的GFP‑LC3慢病毒载体，在显微镜下观察细胞生长状态，排除MOI值过高导致细胞凋亡的分组。收集各组样品，EdU检测各组细胞的增殖效率，同时通过western‑blot检测游离的GFP蛋白和自噬标志蛋白LC3‑Ⅰ（16 ku）与LC3‑Ⅱ（14 ku）之间的转化和比例及荧光显微镜定位LC3蛋白在细胞中的表达情况综合评判该MOI值在鸡生殖细胞中的适用性。本发明操作简单，切实可行，探讨GFP‑LC3慢病毒载体在鸡生殖细胞中的转染条件是将为自噬在胚胎干细胞向原始生殖细胞的诱导分化中的作用研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及GFP-LC3慢病毒载体转染鸡生殖细胞确定最佳效果的MOI值，具体是一种研究鸡生殖细胞自噬的方法，属于生物技术领域。

背景技术

自噬是一种在真核细胞内保守的降解过程，从单细胞的酵母到哺乳动物中都普遍存在。自噬通过降解细胞内受损的蛋白、细胞器、细胞质以及入侵的微生物等来维持机体的稳态。通过电镜检测自噬体及其相关结构是检测自噬的金标准，但由于电镜操作及数据分析专业性要求较高，目前的文献报道中最常用的方法有Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ之间的转化和比例变化，以及通过荧光显微镜观察LC3点状聚集物的形成，这些方法都可以监测自噬发生的程度。

利用GFP示踪LC3蛋白来检测自噬流是一种常见的经典的方法。当利用转基因的方法，将GFP融合连接到LC3基因上后，当细胞自噬未发生时，GFP-LC3蛋白将随机分布在细胞质中，而当细胞自噬发生时，GFP-LC3蛋白将作为双层膜的主要组成部分，聚集在一起，在荧光显微镜下，可以看到聚集所形成的绿色点状，然后，参与自噬体的构成和运输。当自噬体运送到溶酶体后，LC3蛋白很快就被溶酶体降解，而GFP具有一定抵抗水解的能力，因此，也可以利用western-blot和荧光显微镜观察检测游离的GFP蛋白的方法，来观测自噬体是否被溶酶体降解。

发明内容

慢病毒GFP-LC3载体转染细胞是检测自噬流是一种常见的经典的方法。但是该病毒载体在鸡的生殖细胞中转染的最佳MOI值尚未可知。MOI=（病毒滴度×病毒体积）/细胞数目。发明人一直致力于鸡原始生殖细胞的研究，拥有成熟的分离细胞和转染细胞技术，但不同载体在细胞中发挥的效果不同，若MOI值偏低，则会导致转染效果不佳，影响对自噬水平的评价，达不到预期效果；若MOI值偏高，则会影响细胞增殖速率，导致细胞凋亡。因此有必要进行该发明，确定GFP-LC3慢病毒载体在生殖细胞中的最佳转染MOI值，为研究自噬在胚胎干细胞向原始生殖细胞的作用研究奠定基础。

本发明的技术方案如下：

首先在生殖细胞中添加雷帕霉素激活细胞自噬，转染不同MOI值的GFP-LC3慢病毒载体，在显微镜下观察细胞生长状态，排除MOI值过高导致细胞凋亡的分组。收集各组样品，EdU检测各组细胞的增殖效率，同时通过western-blot检测游离的GFP蛋白和自噬标志蛋白LC3-Ⅰ（16 ku）与LC3-Ⅱ（14 ku）之间的转化和比例及荧光显微镜定位LC3蛋白在细胞中的表达情况综合评判该MOI值在鸡生殖细胞中的适用性。

本发明的有益效果如下：

本发明操作简单，切实可行。发明人一直致力于鸡的胚胎干细胞向原始生殖细胞分化的研究，具备成熟的细胞分离培养技术，具有该发明所需具备的设备及研究基础。发明人前期对鸡的胚胎干细胞向原始生殖细胞诱导过程中测序发现自噬信号通路被激活，自噬相关基因INS、VAC8、ATG7、ATG8表达上调，AMPK、ATG4表达下调。这启发探讨自噬在原始生殖细胞诱导分化中的作用。而探讨GFP-LC3慢病毒载体在鸡生殖细胞中的转染条件是将为自噬在胚胎干细胞向原始生殖细胞的诱导分化中的作用研究奠定基础。

具体实施方式

1.设置GFP-LC3慢病毒载体的MOI值梯度转染生殖细胞