[发明专利]一种基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测样品的基因组DNA；

2）LAMP扩增：以步骤1）提取的基因组DNA作为模板，在LAMP扩增体系中进行LAMP扩增，65℃孵育得到LAMP扩增产物；

所述步骤2）的扩增产物含有限制性内切酶ScrFI的识别位点CCGGG和切刻内切酶识别位点GAGTC；

3）对步骤2）所得的LAMP扩增产物进行ScrFI限制性内切酶切割得到限制酶切割产物；

4）步骤3）得到的限制酶切割产物通过切刻内切酶切刻、DNA聚合酶延伸及链置换过程的循环往复产生多条单链DNA：在步骤3）得到的限制酶切割产物中加入1× IsothermalAmplification Buffer II Pack缓冲液、Bst 3.0 DNA聚合酶、Nt.BstNBI切刻内切酶和dNTPs，并用ddH₂O补足，58.8℃孵育10 min；

5）富G序列的产生：在步骤4）得到的产物中加入1μM的分子机器M-G继续孵育，然后95℃孵育5min后立即置于冰上；

6）显色反应：在30μL步骤5）得到的含富G序列的产物中加入1× HEPES缓冲液、辅因子氯高铁血红素以及HCl混匀，随后加入ABTS^2-和H₂O₂，使反应终体积为100μL，通过反应显色实现对沙门氏菌的可视化检测；

所述步骤2）中LAMP扩增的引物为内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1、环引物2，其核苷酸序列如下所示：

内引物1：

TCCCGGCAGAGTTCCCATTGAAGAGTCATCATGACGCAGCTGTTGAA

内引物2：TTCCCGCTGCCGGTATTTGTTGCTACGTTTTGCTTCACGGA

外引物1：GCGATAATATGGGGCGGAAT

外引物2：CGCCTTTGCTGGTTTTAGGT

环引物1：TATTCGGTGGTTTTAAGCGTACTC

环引物2：GCCGTAACAACCAATACAAATGG；

所述步骤5）中的分子机器M-G由三部分依次组成：第一部分为LAMP扩增产物互补区、第二部分为切刻内切酶识别位点互补区、第三部分为富G序列互补区；

分子机器M-G的核苷酸序列为：

TCCCAACCCGCCCTACCCTTTTGACTCGGCAGAGTTCCCATTGAAAT；

其中，LAMP扩增产物互补区的核苷酸序列为GGCAGAGTTCCCATTGAAAT，切刻内切酶识别位点互补区的核苷酸序列为GACTC，富G序列互补区的核苷酸序列为TCCCAACCCGCCCTACCC。

2.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤2）中的LAMP扩增体系的总体积为10μL，其中包括1μL基因组DNA模板、1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mM dNTPs、3.2U Bst DNA Polymerase Large Fragment、1× ThermoPolBuffer、6mM MgSO₄。

3.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤3）中ScrFI限制性内切酶切割的切割条件为：10μL LAMP扩增产物、50mM Tris-HCl缓冲液、100mM NaCl、6mM MgSO₄、100μg/mL牛血清白蛋白、10U限制性内切酶ScrFI、ddH₂O补足至20 μL，37℃孵育60min后，95℃处理10 min。