[发明专利]一种快速鉴定植物产黄酮内生菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速鉴定植物产黄酮内生菌的方法，该方法设计了以黄酮类物质代谢途径中4个关键功能基因(pal、4cl、chs、f3h)为基础的特异性通用引物，每个基因选取4个物种的序列作为模板，在相似度较高的单个外显子区域的保守区域内进行设计。将筛选到的内生菌进行基因组DNA提取，然后依次进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图谱是否存在150‑250bp特异性片段来判断内生菌是否能够产黄酮。本发明利用基因的特异性引物对产黄酮内生菌进行简单、快速、准确的初步鉴定，为进一步的药物研究和开发提供了新的思路。

技术领域

本发明属于细菌性能特征鉴定技术领域，涉及低成本、快速检测判断植物内生菌是否具有产黄酮能力的方法。

背景技术

黄酮类物质作为一种重要的中药成分，被广泛用于心脑血管疾病的治疗，其主要来源于银杏叶片的提取，产量较高，凭借普通的分光光度法和显色反应就能够实现准确的定量和定性分析。但是，银杏作为具有“活化石”美誉的保护植物，其现有植株的数量严重阻碍了心脑血管药物的开发和利用，所以尽快找到新的黄酮来源成为了该研究领域亟待解决的难题。西药的研究和开发模式为我们提供了思路，已有研究表明，部分产黄酮内生菌存在和植物体内极其相似的黄酮类物质代谢途径，从而微生物发酵生产中药前体物质和重要成分成为了可能。但是已有报道的微生物代谢产量远低于植物提取，从而导致先前用于植物提取检测的手段的适用性和灵敏性明显下降，检测可信度也随之较低。而后，学者们开始使用高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)手段来进行检测，灵敏度和检测可信度大大提高，但是加大了样品处理和制备的难度，成本高，耗时长，干扰大，成为了新的缺点。为了实现快速准确，高效地检测是否具有产黄酮能力，本发明构建了一种低成本、快速鉴定产黄酮内生菌的方法。

发明内容

本发明的目的在于通过设计以黄酮类物质代谢途径中4个关键功能基因(pal、4cl、chs、f3h)为基础的特异性通用引物，提供一种低成本、快速鉴定植物产黄酮内生菌的方法，克服了传统检测方法的不足。

本发明是通过以下技术方案实现的：

每个基因选取多个物种的多条序列作为模板，在相似度较高的单个外显子区域的保守区域内进行设计。将筛选到的内生菌进行基因组DNA提取，然后依次进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图谱是否存在150-250bp特异性片段来判断内生菌是否能够产黄酮。本发明利用基因的特异性引物对产黄酮内生菌进行简单、快速、准确的初步鉴定。

具体步骤如下：

(1)基因序列查找：在NCBI基因库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索黄酮代谢途径中关键的苯丙氨酸转氨酶基因(pal)、4-香豆酸-辅酶A连接酶基因(4cl)、查尔酮合成酶基因(chs)和黄烷酮3羟化酶基因(f3h)共4个，每个基因选取4条来自不同物种的序列作为同源分析的模板，比对每个基因4条同源序列的外显子信息，选取合适的外显子序列；

(2)引物设计：分别对上述外显子序列进行同源性比对，在保守区域进行特异性引物设计并合成；

(3)内生菌基因组DNA的提取；

(4)PCR扩增和电泳分析：对内生菌的DNA样品进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，分析条带的特异性，结合测序推断内生菌是否具有产黄酮的能力。

步骤(1)中所使用的作为同源分析模板的苯丙氨酸转氨酶基因的GeneID为26804051、34443904、4990844、7912474，4-香豆酸-辅酶A连接酶基因的Gene ID为7911515、4982926、3510690、26803416，查尔酮合成酶基因的Gene ID为26807749、7918111、34450662、4981042，黄烷酮3-羟化酶基因的Gene ID为7917607、26804499、4986300、34445513，一共16条基因序列；见序列表SEQ ID NO.1-16。