[发明专利]一种筛选鉴定胁迫应答基因表达调控因子的方法

权利要求书

1.一种筛选和鉴定胁迫应答基因的表达调控因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 将待筛选鉴定细胞悬浮于裂解缓冲液中，加入溶菌酶溶液混合均匀，放置10-20分钟，离心分离上清，得到细胞裂解液；

b. 提取待筛选鉴定细胞基因组DNA，然后用限制性内切酶Mnli消化处理，得到消化的基因组DNA；

c. 将步骤a制备的细胞裂解液、步骤b制备的消化的基因组DNA和结合缓冲液混合，待蛋白与DNA充分结合后，上样到预先清洗的过滤分析柱上，离心弃去流出液，用过滤清洗缓冲液清洗多次，用洗脱缓冲液洗脱获得蛋白结合DNA片段；

d. 将洗脱的蛋白结合DNA片段与适配子连接，用带有XbaI序列的正向引物和带有HindIII序列的反向引物，通过对各个5′适配子和3′适配子进行PCR扩增，扩增产物用XbaI和HindIII消化并克隆至pACYC-Luc载体中产生对应的文库，转化DH5α后，在Amp抗生素板上筛选抗性克隆；

e. 选取抗性克隆进行胁迫诱导处理，收集细胞制备细胞裂解液并进行荧光素酶活性测定，选择大于2倍诱导的克隆，利用测序和常规生物信息分析方法进一步鉴定克隆中的胁迫应答基因表达调控因子；

所述的步骤d的适配子为如下所示8种：

AA5：5’-ATGGATAGGTCGGTGA-3’，3’A-TACCTATCCAGCCACT-5’;

AA3: 5’-GACGCACCTTGAGGC-3’ ，3’A-CTGCGTGGAACTCCG-5’;

AG5: 5’-ATGGATAGGTCGGTGA-3’ ，3’G-TACCTATCCAGCCACT-5’;

AG3: 5’-GACGCACCTTGAGGC-3’ ，3’G-CTGCGTGGAACTCCG-5’；

AC5: 5’- ATGGATAGGTCGGTGA-3’，3’C-TACCTATCCAGCCACT-5’;

AC3: 5’-GACGCACCTTGAGGC-3’ ，3’C-CTGCGTGGAACTCCG-5’;

AT5: 5’-ATGGATAGGTCGGTGA-3’，3’ T-T ACCTATCCAGCCACT-5’;

AT3: 5’-GACGCACCTTGAGGC-3’ ，3’T-CTGCGTGGAACTCCG-5’；

5′适配子AA5、AG5、AC5和AT5用于连接DNA片段的5'端，3′适配子AA3、AG3、AC3和AT3用于连接DNA片段的3'端；所述的PCR扩增是扩增10个PCR循环；

所述的步骤a的裂解缓冲液含有10 mM Tris-HCl、0.1 M NaCl、1 mM乙二胺四乙酸和质量分数0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚，pH 8.0；

所述的步骤a中加入溶菌酶溶液混合后溶菌酶在混合体系中的终浓度为0.25mg/mL；

所述的步骤c中将步骤a制备的细胞裂解液、步骤b制备的消化的基因组DNA和结合缓冲液混合，混合体系为：5μL细胞裂解液、15 μL 2×结合缓冲液、5μL消化的基因组DNA和5μLddH₂O；所述的结合缓冲液含有40mM 4-（2羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸、pH7.6、20mM硫酸铵、2mM二硫苏糖醇、20mM KCl和质量分数0.4% Tween-20；

所述的细胞为大肠杆菌DH5α。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c的过滤清洗缓冲液含有100 mM Tris-HCl、2.5 mM EDTA和质量分数0.1% Tween-20，pH 7.6。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c的洗脱缓冲液为质量分数0.5% SDS水溶液。