[发明专利]一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法

权利要求书

1.一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因；

(2)以步骤(1)中所述的编码锰过氧化物酶的基因为模板，进行PCR扩增，与穿梭质粒载体pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用电转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp；

(3)协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料：首先将步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌与粗糙脉胞菌、重组S.pombe-man和产朊假丝酵母混合，并添加氮源、CaCl₂、MnSO₄、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行菌酶协同混菌发酵玉米秸秆；并控制所有物质组成的发酵体系的含水量；所述的重组S.pombe-man发酵菌株是将来源于枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因序列，根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化后导入粟酒裂殖酵母中，构建的一株重组甘露聚糖酶酵母工程菌，记为S.pombe-man。

2.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组穿梭质粒为pREP-mnp；所述的大肠杆菌是6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缺陷型粟酒裂殖酵母是6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母。

4.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和产朊假丝酵母的总接菌量为1％-15％；所述粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和产朊假丝酵母的接种体积比例为2:4:4:2；整个发酵体系中的总含水量为50％-70％。

5.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的氮源由尿素和硫酸铵组成，其中尿素的用量为玉米秸秆质量的0.5％-1％，硫酸铵的用量为玉米秸秆质量的1％-4％；所述CaCl₂的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％，MnSO₄的用量为玉米秸秆质量的0.1％-0.7％，葡萄糖氧化酶的用量为玉米秸秆质量的0.2％-0.6％，漆酶的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％。

6.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述漆酶的酶活力为10 000U/g，葡萄糖氧化酶的酶活力为200U/g；所述小分子物质激活剂为草酸和Tween-80；所述草酸在发酵体系中的终浓度为0.2-1mM，复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为玉米秸秆质量的0.02％。

7.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵的温度为26-37℃，发酵时间为2-4天。

8.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌还可应用于酶解玉米秸秆木质素的用途，具体步骤如下：培养步骤(2)中所述的重组酵母工程菌，得到菌液，离心收集粗酶液，粗酶液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的锰过氧化物酶；并添加CaCl₂、MnSO₄、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行多酶协同酶解玉米秸秆木质素。