[发明专利]一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒，其包括CRISPR‑Cas检测体系：如本发明所述的crRNA、引物对、Cas蛋白和核酸探针。本发明还提供了一种呼吸道病原的核酸的检测方法、一种crRNA和引物对的组合及其应用。本发明的试剂盒和检测方法不依赖于大型仪器而可通过肉眼直接进行结果观测，在温和的条件即可实现检测，检测更方便；使用本发明的试剂盒和检测方法可用于高效、快速地检测/诊断呼吸道病原（例如甲型流感、乙型流感以及新型冠状病毒等），特异性和灵敏度均较高，可用于呼吸道病原的检测与筛查，例如快速区分包括甲型流感、乙型流感以及新型冠状病毒在内的多种呼吸道病原。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

COVID-19案例很快出现在世界各国，并被世界卫生组织（World HealthOrganization，WHO）宣布为世界性的公共卫生威胁。虽然目前报道COVID-19的中位发作时间为4-5天，但有一小部分感染者是在14天隔离之后才出现症状。COVID-19最常见的症状是咳嗽和发烧。不过，也有一定比例的病人并不呈现症状，包括X光检测及CT检测。COVID-19出现症状时间的不确定以及无症状感染的情况给疾病的早期精准检测带来了极大障碍，因而也使得疾病防控极具挑战。这使得COVID-19病原核酸的分子检测变得尤为重要。

引起COVID-19的病原已经被确认为是β属冠状病毒，被命名为SARS-CoV-2。和其他冠状病毒类似，SARS-CoV-2是单链、正义的RNA病毒。SARS-CoV-2和SARS-CoV以及中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）分别具有79%和50%的核酸相似性。针对COVID-19的现有分子诊断方法主要是基于反转录PCR（RT-PCR）。SARS-CoV-2的E、N以及ORF1ab基因是常用的RT-PCR的靶标基因。高通量的RT-PCR平台也已被研发出来用于大规模的诊断。不过，RT-PCR通常依赖于特别的、大型的仪器，因此大规模的RT-PCR检测往往局限于在医院的病人。

最近研究表明，Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicrRepeats （CRISPR）技术可用于病原的低成本、便携式的分子检测。CRISPR以及CRISPR-associated genes（Cas）基因是细菌抵御外源病毒感染的免疫系统。CRISPR的模块特性使得此技术被广泛应用于基因组工程中。基于CRISPR的病原核酸的分子诊断依赖于Cas核酸酶的RNA或DNA的靶向活性。同时，不同CRISPR系统可以组合实现对病原的多重检测。在最近中国爆发的非洲猪瘟疫情中，很多基于CRISPR-Cas12a的诊断平台被开发出来。