[发明专利]天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化-还原偶联制备精草铵膦中的应用

说明书

本发明公开了一种天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化‑还原偶联制备精草铵膦中的应用，以D,L‑草铵膦为底物，在有氧环境及过氧化氢酶存在的情况下，利用氨基酸氧化酶突变体或含有氨基酸氧化酶突变体的细胞作为生物催化剂，进行氧化反应，获得L‑草铵膦的前体酮2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸再在草铵膦脱氢酶的作用下，催化生成L‑草铵膦，本发明方法原料转化率和收率高，产物易于分离提纯且手性纯度较高；与其他催化工艺相比，工艺相对简单，转化率高达99％。

(一)技术领域

本发明涉及生物化工领域，涉及一种精草铵膦(手性纯L-草铵膦)的生产方法；是一种利用来源于微生物的氨基酸氧化酶生产光学纯L-草铵膦的方法。

(二)技术背景

草铵膦(glufosinate-ammonium)化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂是谷氨酰胺合成酶抑制剂。

众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；中国农业部已发布公告说明，百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；全球越来越多国家禁用或限用。而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。

手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。

化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。

生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：

(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本加高，不利于工业化生产。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。

(2)以外消旋草铵膦的前提为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。例如一种采用α-胰凝乳蛋白酶拆分双丙氨膦乙酯制备L-草铵膦的方法，该法首先经过3步反应将外消旋的草铵膦合成双丙氨膦二乙酯，接着用碱性mesinterico肽酶将其C端脂基水解。再经α-胰凝乳蛋白酶催化水解肽键。在该步反应中，α-胰凝乳蛋白酶能选择性水解L-双丙氨膦乙酯，生成L-草铵膦乙脂。最后利用磷酸二脂酶水解P端酯基得到L-草铵膦。