[发明专利]天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化-还原偶联制备精草铵膦中的应用

权利要求书

1.一种天冬氨酸氧化酶突变体，其特征在于所述天冬氨酸氧化酶突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列进行下列之一突变：(1)第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸；(2)第54位精氨酸突变为组氨酸；(3)第57位酪氨酸突变为天冬酰胺；(4)第219位精氨酸突变为赖氨酸；(5)第312位天冬酰胺突变为组氨酸；(6)第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸；(7)第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺；(8)第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第219位精氨酸突变为赖氨酸；(9)第219位精氨酸突变为赖氨酸、第312位天冬酰胺突变为组氨酸；(10)第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第312位天冬酰胺突变为组氨酸；(11)第54位精氨酸突变为组氨酸、第219位精氨酸突变为赖氨酸、第312位天冬酰胺突变为组氨酸；(12))第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第312位天冬酰胺突变为组氨酸；(13)第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸、第219位精氨酸突变为赖氨酸、第312位天冬酰胺突变为组氨酸；(14)第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第219位精氨酸突变为赖氨酸；(15)第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第219位精氨酸突变为赖氨酸、第312位天冬酰胺突变为组氨酸。

2.如权利要求1所述天冬氨酸氧化酶突变体，其特征在于所述氨基酸氧化酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第219位精氨酸突变为赖氨酸且第312位天冬酰胺突变为组氨酸。

3.一种权利要求1所述天冬氨酸氧化酶突变体在氧化-还原偶联制备L-草铵膦中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含天冬氨酸氧化酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以D,L-草铵膦为底物，加入过氧化氢酶，以pH值7.0-8.0的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃、通气量1-3L/min、600rpm下进行反应，再加入作为辅助催化剂的含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、葡萄糖和无机氨基供体，在30℃、600rpm下反应完全后，获得含L-草铵膦的反应液，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述草铵膦脱氢酶突变体基因编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示；所述葡萄糖脱氢酶基因编码蛋白氨基酸序列为SEQID NO.6所示。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述无机氨基供体为硫酸铵。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述催化剂加入量以反应体系体积计为10-30g/L；所述底物加入量以反应体系体积计为200-800mM，所述过氧化氢酶加入量以反应体系体积计为30-50万U/L。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述辅助催化剂加入量以反应体系体积计为10-30g/L，所述葡萄糖加入量以反应体系体积计为100-500mM，所述无机氨基供体加入量以反应体系体积计为200-1000mM；所述无机氨基供体加入量以反应体系体积计为200-1000mM。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的反应按如下步骤进行：将含氨基酸氧化酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体与过氧化氢酶，D,L-草铵膦和pH＝8.0的磷酸缓冲液混合，在通气量1L/min、30℃、600rpm磁力搅拌转速下反应8h，流加氨水使反应液pH维持在8.0，接着加入含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、葡萄糖、硫酸铵，在40℃、600rpm磁力搅拌转速下反应，流加氨水使反应液pH维持在7.5，获得含L-草铵膦的反应液。