[发明专利]一种基于RAA-LFD检测新冠病毒的方法

权利要求书

1.一种基于RAA-LFD检测新冠病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：样本留取：采集样本，包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、血液标本、血清标本、粪便标本、眼结膜拭子；

步骤2：核酸提取：采用闪电核酸释放剂提取全血、血清、血浆、尿液、唾液、口腔拭子、鼻咽拭子、细胞悬液等样品的核酸(RNA)；

步骤3：标准质粒构建：新冠病毒COVID-19N基因全序列的重组质粒2019-nCoVN全长质粒V2，以紫外分光光度计测量重组质粒OD260、OD280及OD260/OD280值，并重复3次，确定质粒DNA浓度和纯度，按照梯度稀释：1×10⁸拷贝/μL至1×10¹拷贝/μL，-20℃保存备用；

步骤4：以新冠病毒COVID-19N基因作为靶基因，分析新冠病毒COVID-19N基因的序列特点后，应用Primer Premier 5.0软件设计种属特异性扩增引物；

步骤5：使用RAA核酸扩增试剂盒进行RAA反应体系的配制；

步骤6：RAA反应结束后，打开Eppendorf管，吸取扩增产物至一新的Eppendorf管中，做好标记，并稀释50倍，马上进行试纸条检测；

步骤7：利用试剂盒进行RAA扩增和试纸条检测，获得产品的检测下限为1×10¹拷贝/μL；

步骤8：以超纯水作为阴性对照，以1×10⁰拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、重组质粒为模板，进行3次平行试验。

2.如权利要求1所述的基于RAA-LFD检测新冠病毒的方法，其特征在于，步骤4中与相近的物种冠状病毒序列做比对，包括SARS-COV、HCOV-229E、HCOV-U1、HCOV-NL63和HCOV-OC43。

3.如权利要求1所述的基于RAA-LFD检测新冠病毒的方法，其特征在于，步骤4探针序列位于扩增引物中间区段，经四氢呋喃修饰。

4.如权利要求1所述的基于RAA-LFD检测新冠病毒的方法，其特征在于，步骤5加样顺序为阴性质控样本、待检样本，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖。

5.如权利要求1所述的基于RAA-LFD检测新冠病毒的方法，其特征在于，步骤7在初始模板为1×10³～1×10⁶拷贝/μL的情况下，试纸条显色速度很快，从试纸条插入PCR反应管，至条带显色不超过3分钟。