[发明专利]一种杀菌产品有效作用时间与杀菌效力的检测方法

权利要求书

1.一种杀菌产品有效作用时间与杀菌效力的检测方法，其特征是，包括如下步骤：

（1）测试所需载体套件：测试前根据实际作用面积选择对应载体套件，若实际作用面积等于或大于25cm²，选取25cm²的载体套件，若实际作用面积小于25cm²，选取用4cm²的载体套件，所述25cm²载体套件的载体板均分成25格，每格为10mm×10mm，所述4cm²载体套件的载体板均分成4格，每格为10mm×10mm；

（2）使用载体套件进行有效作用时间筛选：其步骤如下，

步骤1：载体套件染菌，用浓度为5.0×10⁸–1.0×10⁹cfu/ml的菌悬液滴给载体套件染菌，若为25cm²的载体套件，用微量移液器分别向载体板上的每个网格滴加4µl 菌悬液并均匀涂在网格中，直至滴满每格，待干燥后，其载体板载菌量应在5.0×10⁷–1.0×10⁸cfu的范围内，若为4cm²的载体套件，用微量移液器分别向载体板上的每个网格滴加5µ菌悬液并均匀涂在网格中，直至滴满每格，待干燥后，其载体板载菌量应在1.0×10⁷–2.0×10⁷cfu的范围内；

步骤2：测试不同作用时间，取出步骤1已染菌的载体板，将其载菌面朝下放入向装有10ml待测样品的无菌广口瓶内，开始计时并震荡60秒，当计时到60秒、3分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟时，每个时间点用移液枪分别取20 µl样品滴入10支10ml恢复培养基中并作为实验测试组，此步骤重复3次；

步骤3：测试阴性与阳性对照组，阳性对照组包含：载菌量计算、培养基有效恢复对照和有效中和对照，所述载菌量计数应将载体板放入装有10ml 0.1%蛋白胨水的平底无菌瓶子中，震荡60秒后做菌株计数，载菌量应在套件规定参数内，所述有效恢复对照将100µl含10-100cfu的菌悬液加入10ml恢复培养基，所述有效中和对照应将20µ待测样品加入10ml恢复培养基，震荡10秒后将100µl含10-100cfu的菌悬液加入同一支培养基，阴性对照组：取3支恢复培养基，1支加20µl待测样品，1支加入20µl无菌蛋白胨盐水，1支保持未开封，此后，将所述测试组60支培养基与所述对照组5支培养基在37℃培养箱中培养48小时，培养后进行检查，若三次测试中每次该时间点的10支培养基均为阴性，且通过阳性与阴性对照，则将该时间点作为有效作用时间，并用于下述使用载体套件进行单位面积杀菌效力的检测中；

（3）使用载体套件进行单位面积杀菌效力测试：使用载体套件进行有效作用时间筛选后，根据待测产品的实际用法将染菌后的载体板进行如下三种检测作用方法的一种或多种：

浸泡作用法：染菌后将30组载体板载菌面朝下，分别放入装有10ml待测样品的无菌广口瓶中，震荡60秒，并且浸泡至有效作用时间后，取出该载体板，再将其放入装有10ml中和液的无菌广口瓶中，震荡60秒，作为载体板测试组，与此同时，从载体板测试组取1ml测试后的样品液加入9ml中和液，震荡10秒，作为样品残留菌计数组，然后，将载体板测试组与残留菌计数组在中和液中中和10分钟后进行菌株计数，此外，取3套染菌载体板分别放入10ml0.1%蛋白胨水中，震荡60秒后，做菌株计数，其计数结果作为阳性对照，另取一套未染菌载体板重复前述步骤作为阴性对照，最后，所述载体板测试组、样品残留菌计数组和所述对照组于37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数；

喷洒作用法：测试前将喷壶经消毒及无菌环境进行风干；然后取400ml待测样品加入喷壶内，测量喷洒10ml待测样品完全覆盖载体板面积所需的喷洒次数，此后，将喷壶用架子安装在距离样品20-30cm 处，取出30个装有干燥后的染菌载体套件的培养皿，并用喷壶分别向染菌载体板均匀地喷洒待测样品，其喷洒次数为测试前测量的次数，待作用至有效作用时间后，用无菌镊子取出载体板，再将其载菌面朝下转移至装有10ml 中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，作为载体板测试组用于菌株计数，与此同时取1ml测试后样品液加入9ml中和液，震荡10秒，作为测试样品残留菌计数组，然后将载体板测试组与样品残留菌计数组均在中和液作用10分钟后进行菌株计数，此外，取3套染菌载体板分别放入10ml 0.1%蛋白胨水中，震荡60秒后做菌株计数，其计数结果作为阳性对照，另取一套未染菌载体重复以上步骤作为阴性对照，最后，载体板测试组、样品残留菌计数组与所述对照组在37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数；

擦拭作用法：测试前将31个无菌棉球放入500ml无菌广口瓶，加入310ml待测样品浸泡2分钟，另外将3个无菌棉球放入50ml无菌广口瓶，加入30ml无菌硬水用于对照组，测试时，取30个装有干燥后的染菌载体套件的培养皿，分别用泡过样品的无菌棉球擦拭载体板，擦拭时从左上端网格开始，从左到右从上到下“Z”字形擦拭3次，待其作用至有效作用时间后用无菌镊子取出载体板，并将其载菌面朝下转移至装有10ml 中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，作用10分钟后，作为载体板测试组用于菌株计数，另取3套染菌载体分别用浸泡过无菌硬水的无菌棉球取代浸泡过样品的棉球，与测试组重复相同步骤，用于物理除菌对照组，再取3套染菌载体分别放入10ml 0.1%蛋白胨水中，震荡60秒后做菌株计数，计数结果作为阳性对照，以及另取一套未染菌载体与测试组重复相同步骤作为阴性对照，载体板测试组，物理除菌组与所述对照组在37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数；

所述三种检测作用方法的载体板测试组为30组，并记为Ct1-Ct30，样品残留菌计数组为30组，并记为Cr1-Cr30，阳性计数对照组为3组，并记为Cc1-Cc3，物理除菌对照组为3组，并记为Cp1-Cp3；

（4）利用公式计算单位面积杀菌效力：其步骤如下：

步骤1：将使用载体套件进行单位面积杀菌效力测试中的载体测试组菌落数（Ct1-Ct30）、样品残留菌计数组菌落数（Cr1-Cr30）、阳性对照组菌落数（Cc1-Cc3）和物理除菌组菌落数（Cp1-Cp3）使用求和公式进行求和计算，其菌落数之和分别为Ct、Cr、Cc和Cp，

其菌落计数求和公式（cfu）：

；

步骤2：根据测试选取所需载体套件大小与三种检测作用方法选择下述公式代入步骤1的菌落数求和计算结果并得出单位面积杀菌数与单位面积杀菌对数值，

应用于25cm²的载体板，其浸泡作用法和喷洒作用法杀菌效力计算公式如下：

平均每平方厘米杀菌数（cfu/cm²）：

平均每平方厘米杀菌对数值：

应用于25cm²的载体板，其擦拭作用法计算公式如下：

平均每平方厘米杀菌数（cfu/cm²）：

平均每平方厘米杀菌对数值：

平均每平方厘米净除菌数（除去物理除菌值）（cfu/cm²）：

平均每平方厘米净杀菌对数值（除去物理除菌值）：

应用于4cm²的载体板，其浸泡作用法和喷洒作用法的杀菌效力计算公式如下：

平均每平方厘米杀菌数（cfu/cm²）：

平均每平方厘米杀菌对数值：

应用于4cm²的载体板，其擦拭作用法的计算公式如下：

平均每平方厘米杀菌数（cfu/cm²）：

平均每平方厘米杀菌对数值：

平均每平方厘米净除菌数（除去物理除菌值）（cfu/cm²）：

平均每平方厘米净杀菌对数值（除去物理除菌值）：

。

2.应用权利要求1所述检测方法的载体套件，其特征是，分别为4cm²载体套件与25cm²的载体套件，所述每套载体套件包括：载体板，该载体板为4cm²或25cm²方形结构，其表面设有标记线，并且将其均分成4或25格，每格为10mm×10mm，所述每套载体套件还包括：底座，所述底座为直径50mm或80mm圆形结构，底座的中线上设有一个长15mm的长形漏孔或者两边设有两个长20mm的长形漏孔，底座的表面设有用于载体板的4个方形分布的“L”形卡口。