[发明专利]激活γ-珠蛋白基因表达的方法和组合物

说明书

本发明涉及一种激活γ‑珠蛋白基因转录的新方法。本发明采用含有GATA或其反义互补序列TATC的单链寡核苷酸(ssODN)作为指导信息，在γ‑珠蛋白基因调控区进行基因编辑形成含有GATA的增强子元件，能够促进γ‑珠蛋白基因在成熟红细胞中表达。利用本发明技术进行基因编辑后的造血干细胞具有正常功能，且在分化成红细胞后能显著提高胎儿血红蛋白的表达，因此可用于β‑地中海贫血和镰刀红细胞贫血的临床治疗。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，涉及一种用于激活γ-珠蛋白基因表达的方法、组合物及其应用。该方法采用含有GATA或其反义互补序列TATC的单链寡核苷酸(ssODN)作为指导信息，在γ-珠蛋白基因启动子区进行基因编辑形成含有GATA的红系增强子元件，能够促进γ-珠蛋白基因在成熟红细胞中表达。

背景技术

血红蛋白(hemoglobin，简称Hb)是红细胞内携带和运输氧气的特殊蛋白质。血红蛋白由珠蛋白(globin)和血红素构成。成人体内的血红蛋白主要是由2个α-珠蛋白和2个β-珠蛋白组成的四聚体(α2β2)，成为成人血红蛋白(HbA)。β-珠蛋白的基因(HBB)的突变可引起β-血红蛋白障碍(也称β-血红蛋白病)，包括镰状细胞病(Sickle Cell Disease，SCD)和β-地中海贫血(β-thalassemia，简称β-thal)。镰状细胞性贫血是由β-珠蛋白结构基因的点突变引起的，导致产生异常的血红蛋白(HbS)。β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因表达的部分或完全缺陷引起的，导致成人血红蛋白(HbA)缺陷或缺失。血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失会导致血红蛋白结构异常，这种含有异常血红蛋白的红细胞变形性降低，寿命减短，在骨髓中可能出现原位溶血，进入到外周血液循环后被脾脏等脏器提前破坏，致使贫血、体内铁沉积甚至发育异常。血红蛋白病影响全球数百万人口，目前每年大约有330,000儿童出生患有血红蛋白病，严重威胁人类的健康甚至生命。地中海贫血和镰状细胞病患者主要通过规范性长期输血和去铁治疗来缓解病症，但这种方式不但不能治愈，同时还会带来较高的安全隐患。异体造血干细胞移植是目前唯一能根治地中海贫血和镰状细胞病的治疗技术，然而由于骨髓配型成功率低和免疫排斥风险等因素的限制，在临床上难以大范围应用。因此迫切需要发展新的安全和有效的治疗方法。

人类发育过程中，血红蛋白并不是一直以2个α-珠蛋白和2个β-珠蛋白的形式组成的。在胚胎发育期间和出生后不久，血红蛋白是由两个α-珠蛋白链和两个γ-珠蛋白链组成的四聚体的形式存在(α2γ2)，称之为胎儿血红蛋白(HbF)，它相比于HbA有更强的氧亲和力。随着胎儿的发育，γ-珠蛋白基因逐渐沉默而不表达，而相同基因组位点附近的β-珠蛋白基因逐渐升高表达，在婴儿出生后约半年后，血液中血红蛋白的组成和比例逐渐稳定下来，HbF被成人血红蛋白(HbA)替换，只剩余极低水平HbF(占总血红蛋白的1％以下)。

研究发现，有些人群中一些特殊的位点出现突变，γ-珠蛋白基因转录被激活，导致血红蛋白中HbF比例升高，被称之为遗传性胎儿血红蛋白持续增多(hereditarypersistence of fetal hemoglobin，HPFH)。比如，γ-珠蛋白基因启动子区发现了一些不同类型的突变，如-114至-10213bp del c.、4bp del c.-225至-222、c.-114CT、c.-117GA、c.-158CT、c.-167CT、c.-170GA、c.-175TG、c.-175TC、c.-195CG、c.-196CT、c.-198TC、c.-201CT等，这些天然存在的突变不同程度地提高HbF在总血红蛋白的比例。临床研究发现，少数β-地中海贫血或者镰刀型贫血症患者由于恰好基因组中存在HPFH突变，HbF的表达弥补了HbA的不足，在一定程度上减轻或者缓解了病人的贫血症状，或减少了输血需求。受到该发现的启发，科学家们不断探索各种能够诱导HbF表达的方法来达到治疗β-血红蛋白病的目的。如目前临床上有用羟基脲等药物诱导HbF表达治疗β-血红蛋白病，然而大多数病人中诱导HbF的水平较低，不能够彻底改善病人的状况。