[发明专利]激活γ-珠蛋白基因表达的方法和组合物

权利要求书

1.一种用于非诊断治疗的激活γ-珠蛋白基因表达的方法，该方法包括如下操作：通过基因编辑技术在γ-珠蛋白基因调控区的正义链或反义链人工形成NTG-N(7-8)–WGATAR序列或NAG-N(7-8)–WGATAR序列，使γ-珠蛋白基因的调控区形成包含NTG-N(7-8)–WGATAR序列或NAG-N(7-8)–WGATAR序列或对应的反义互补序列的增强子元件；WGATAR序列对应的反义互补序列为YTATCW，其中W为T或A，R为A或G，Y为T或C，所述N为A、G、C或T；

所述方法中使用包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26所示序列，或者其反义互补序列的ssODN；

所述方法中使用选自SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：75所示序列中的任一种或多种sgRNA。

2.一种用于γ珠蛋白基因调控区基因编辑的组合物，其特征在于，包括ssODN和sgRNA，所述ssODN中含有NTG-N(7-8)–WGATAR序列或NAG-N(7-8)–WGATAR序列或对应的反义互补序列；

WGATAR序列对应的反义互补序列为YTATCW，其中W为T或A，R为A或G，Y为T或C，所述N为A、G、C或T；

所述ssODN为包含SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:22，SEQ IDNO:24，SEQ ID NO:26所示序列，或者其反义互补序列的序列；

所述sgRNA为选自SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：75所示序列中的任一种或多种。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述ssODN为选自SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:65所示序列，或者其反义互补序列。

4.如权利要求2所述的组合物，其中所述ssODN进行了化学修饰，其5′和3′端是硫代磷酸修饰的核苷酸。

5.如权利要求4所述的组合物，所述基因编辑采用CRISPR-Cas编辑系统进行。

6.如权利要求5所述的组合物，所述CRISPR-Cas编辑系统是CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12系统。

7.如权利要求5所述的组合物，所述组合物中CRISPR-Cas编辑系统是指导RNA以及Cas蛋白组成的核糖核蛋白复合物。

8.如权利要求5所述的组合物，所述组合物中CRISPR-Cas编辑系统是编码Cas蛋白的mRNA以及gRNA组成的RNA复合物。

9.如权利要求5所述的组合物，所述组合物中CRISPR-Cas编辑系统是表达Cas蛋白及gRNA的质粒。

10.如权利要求4所述的组合物，所述sgRNA是化学合成的，或者体外转录的。

11.一种激活γ-珠蛋白基因的试剂盒，其特征在于，包括：

(1)如权利要求2-10任一项所述的组合物；

(2)表达Cas9或Cas12蛋白的载体，Cas9或Cas12蛋白，Cas9或Cas12蛋白对应的mRNA中的至少一种。

12.一种造血干细胞，其特征在于，其通过采用电转方法将如权利要求2-10任一项所述的组合物转入造血干细胞中而得到。

13.如权利要求2-10任一项所述的组合物在制备用于治疗β-地中海贫血或者镰刀型贫血症的细胞或药物中的用途。

14.如权利要求11所述的试剂盒在制备用于治疗β-地中海贫血或者镰刀型贫血症的细胞或药物中的用途。

15.如权利要求12所述的造血干细胞在制备用于治疗β-地中海贫血或者镰刀型贫血症的细胞或药物中的用途。