[发明专利]一种分离细胞外囊泡的方法和检测细胞外囊泡的试剂盒

说明书

本发明公开了一种分离细胞外囊泡的方法和检测细胞外囊泡的试剂盒，用MaxiSorp酶标板从样品中分离细胞外囊泡，即将封闭处理后的MaxiSorp酶标板与样品进行孵育，再洗涤，洗涤后MaxiSorp酶标板的孔板上结合有细胞外囊泡。与现有技术相比，本发明能够有效解决现有技术中免疫捕获所需的抗体成本较高、效率有限；细胞外囊泡的尺寸不一，利用大小分离效率较低等问题，其成本低，速度快，效率高于抗体捕获。

技术领域

本发明涉及分离领域，具体涉及一种分离细胞外囊泡的方法和检测细胞外囊泡的试剂盒。

背景技术

细胞外囊泡是细胞分泌的微小囊泡，存在于血液、尿液等体液当中，含有多种疾病相关的标志物，包括DNA、RNA、蛋白质。因此是液体活检的重要检测对象。将细胞外囊泡从生物样品中分离是检测的必要步骤，是细胞外囊泡检测临床应用的主要难点之一。

现有的常用技术包括：基于密度的超速离心、基于抗体的免疫捕获、基于大小的过滤分离。但这些方法存在各种缺点：超速离心需要昂贵的超速离心机；免疫捕获所需的抗体成本较高、效率有限；细胞外囊泡的尺寸不一，利用大小分离效率较低。因此，需要开发一种新的工艺来分离细胞外囊泡。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分离细胞外囊泡的方法。

本发明还要解决的技术问题是提供一种检测细胞外囊泡的试剂盒。

发明思路：MaxiSorp表面能从样品中捕获细胞外囊泡。MaxiSorp表面是一种常用的商业化酶标板亲水性表面(NUNC公司)，对亲水/疏水混合样品的吸附能力较强，通常用于固定抗体。在用牛血清白蛋白或除去囊泡的牛血清封闭了MaxiSorp酶标板上的蛋白结合位点之后，MaxiSorp表面能够有效结合细胞外囊泡，并且结合效率高于常规的CD63或CD9抗体。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种分离细胞外囊泡的方法，即用MaxiSorp酶标板从样品中分离细胞外囊泡。

其中，所述的MaxiSorp酶标板的表面对混合亲水性/疏水性的分子具有高吸引力。

其中，所述的样品为含有细胞外囊泡的血液，或细胞培养液、尿液、唾液等生物样品。

其中，所述的分离细胞外囊泡的方法具体为将封闭处理后的MaxiSorp酶标板与样品进行孵育，让样品中的囊泡与酶标板充分结合，再洗涤以洗去没有结合的蛋白和其他成分，洗涤后MaxiSorp酶标板的孔板上结合有细胞外囊泡，即细胞外囊泡通过疏水/亲水作用力结合在孔板上。

其中，所述的封闭处理为将MaxiSorp酶标板与1％-10％g/mL牛血清白蛋白的PBS溶液、10vt％-100vt％去除细胞外囊泡牛血清的PBS溶液和10vt％-100vt％去除细胞外囊泡人血浆的PBS溶液中的任意一种物质加入到MaxiSorp酶标板(96孔板)中300μL/孔，然后于室温下密闭1-4h；上述封闭处理三种物质的溶剂均为PBS；其中，所述的10vt％-100vt％去除细胞外囊泡的牛血清和10vt％-100vt％去除细胞外囊泡的人血浆为将牛血清和人血浆分别在200000g超速离心过夜去除细胞外囊泡所得。

其中，所述的样品需进行预处理，即将样品先用0.8μm滤膜过滤；再用300kD超滤管对滤液进行超滤，将浓缩液用PBS稀释到样品原来的体积，即得。

其中，所述的孵育为将向封闭处理后的MaxiSorp酶标板(96孔板)中加入100μL样品/孔，然后在室温下孵育1-4h；其中，所述的100μL样品/孔中，若样品的量不足100μL，则用PBS缓冲液补足。

其中，所述的洗涤为用含丙二醇嵌段聚醚(F68)的PBS水溶液洗涤MaxiSorp酶标板的孔板；优选为0.05-1％g/mL F68的PBS水溶液。