[发明专利]一种改良酵母上游激活元件及其在鱼类中的应用

说明书

本发明公开了一种改良酵母上游激活元件及其在鱼类中的应用，是由UAS‑1、间隔序列、UAS‑2、间隔序列、UAS‑3、间隔序列、UAS‑4、间隔序列、UAS‑5、间隔序列、启动子依次组成的非重复序列，其中UAS‑1、UAS‑2、UAS‑3、UAS‑4、UAS‑5的碱基序列均不相同。本发明不仅能够被GAL4蛋白特异识别，而且其CpG位点不易发生甲基化，增强了鱼类中目的基因诱导表达率，从而提高目的蛋白的表达产量，很好的促进GAL4/UAS系统在鱼类中的应用。

技术领域

本发明涉及一种改良酵母上游激活元件及其在鱼类中的应用，属于分子生物学领域。

背景技术

GAL蛋白家族在酵母的半乳糖代谢中起着重要作用。GAL4作为GAL蛋白家族的一员，其作用类似于原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子。酵母中原始的GAL4基因编码含有881个氨基酸的蛋白，该蛋白主要包括N端的DNA结合域和C端的转录激活域（Traven etal., 2006）。上游激活序列UAS（upstream active sequence）是酵母中类似真核生物增强子的一段序列，位于靶基因启动子的上游，其序列特征为：5'-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3'（R代表嘌呤，Y代表嘧啶，N代表任意脱氧核苷酸），GAL4因子以同源二聚体的形式特异识别并结合UAS，并促使UAS下游基因的转录表达（Giniger et al., 1985）。

转基因技术是研究基因功能的有力工具，但是以往的利用特异性启动子或热休克蛋白启动子驱动外源基因表达的方法具有一定的局限性，比如研究的基因如果是致死基因，那么就无法建立转基因家系。利用GAL4/UAS系统，可以分别建立含有GAL4的家系和UAS驱动靶基因表达的家系，只有这两种家系杂交才能调控靶基因的表达，因此GAL4/UAS系统在转基因技术中的应用，可以弥补上述不足。在GAL4/UAS系统的推广应用中，GAL4因子被逐步的改造和优化，使之具有更好的诱导精度和和诱导效率。GAL4蛋白之所以能够特异结合并诱导UAS下游基因的转录表达，是因为GAL4具有能够特异结合UAS的DNA结合域及转录激活域。因此对GAL4蛋白的优化改造，主要是针对GAL4因子含有的这两个功能域。Distel 等在斑马鱼中将GAL4蛋白进行了优化，首先将GAL4的DNA结合域与四环素转录激活子（tTA）的转录激活域融合，其次在5’端融合Kozak序列以增强转录和翻译的效率，在3’端融合兔子的β球蛋白的UTR区以增强mRNA的稳定性，该优化后的GAL4蛋白（KalTA4）在斑马鱼中具有很好的诱导活性和诱导精度，且能够建立含有KalTA4的稳定遗传的斑马鱼家系（Distel etal., 2009），UAS对GAL4/UAS系统诱导效率影响研究，主要集中在UAS拷贝数多少对其诱导效率的研究上。UAS发生甲基化对GAL4/UAS系统诱导效率影响在不同物种中被发现，已经成为共识（Halpern et al., 2008）。UAS序列之所以会发生甲基化，是因为UAS序列是一种重复序列，且中间含有容易发生甲基化的CpG位点，重复序列的CpG位点常常会发生甲基化修饰，而UAS序列甲基化后将严重影响GAL4/UAS系统的诱导表达效率。本发明针对UAS容易发生甲基化影响UAS下游基因的表达的现状，设计一种全新的非重复UAS序列，很大程度生减轻了甲基化症状。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种不易被甲基化的改良型UAS序列，以保证GAL4/UAS系统的诱导表达效率，从而促进GAL4/UAS系统在鱼类中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案之一是：一种改良酵母上游激活元件，其特征在于，该上游激活元件为非重复序列。

优选地，上述改良酵母上游激活元件是由UAS-1、间隔序列、UAS-2、间隔序列、UAS-3、间隔序列、UAS-4、间隔序列、UAS-5、间隔序列、启动子依次组成的非重复序列，其中UAS-1、UAS-2、UAS-3、UAS-4、UAS-5的碱基序列均不相同。

优选地，上述改良酵母上游激活元件的多个间隔序列的长度不一致。