[发明专利]活细胞内同时可视化基因的DNA、mRNA和蛋白的标签及方法

说明书

本发明公开了一种用于活细胞内同时可视化基因的DNA、mRNA和蛋白的三重标签及方法。该标签包含12个TS1重复单元组成的CRISPR‑Tag DNA序列、12个MS2V5单元序列组成的MS2 DNA序列以及含有内含子的蓝色荧光蛋白序列。DNA序列长度短，能通过CRISPR‑Cas9介导的基因重组方式插入目标蛋白编码基因的N端或C端；制备方法先制备TriTag标签，构建可视化稳定细胞系，再构建目标内源基因可视化体系并转染分选，最后可实现活细胞动态成像。本发明的TriTag能够被标记，实现染色质的动态成像，能对内源特定靶基因的染色质动态和基因表达进行直观地可视化，有利于数据的整合和分析，帮助解析基因表达的动态调控机制。

技术领域

本发明涉及生物技术领域的一种TriTag标记成像系统的建立方法，其具体内容涉及到活细胞内同时可视化基因的DNA、mRNA和蛋白的标签及方法，实现对基因表达调控的实时成像与分析。

背景技术

基因表达是遗传信息由基因传递至蛋白质的过程，转录、翻译作为基因表达的两个关键步骤，其整个过程都受到严密调控。但是很少有研究可视化整个基因表达调控过程：即在活细胞中，同时可视化基因的DNA，mRNA和蛋白，揭示基因是如何在染色质层面调控转录水平，进而实现蛋白表达水平的时空调控。

已经有很多工作在活细胞中将RNA可视化。在这些工作中，MS2噬菌体衣壳蛋白结合位点(MS2)定位于基因的5’端非编码区或者3’端非编码区，这两种定位同时能够将成熟的mRNA和新生RNA可视化。但是有工作表明将MS2 序列插入到基因5’端非编码区，在一定程度上影响了基因的表达。因此结合以上两方面考虑，现有的技术无法较为直观、客观地实时捕捉基因转录水平的动态变化。

有一项发表的工作采用了外源报告基因系统，在活细胞内可视化了整个基因表达调控过程：即同时可视化基因的DNA，mRNA和蛋白。该外源报告基因上串联有3个元件：(1)256拷贝的LacO序列以可视化基因的DNA；(2)24 拷贝MS2序列以可视化mRNA；(3)青色荧光蛋白(CFP)以可视化目标蛋白。这项工作同时将成熟mRNA与新生RNA可视化，因此不能清晰捕捉新生RNA 的产生并对转录动态调控进行定量分析。另外，该报告系统3个元件的DNA总长达～20kb，只能用作外源报告基因，在一定程度上限制了这项技术的应用。

因此，现有技术中缺少了能够被广泛使用的，同时实现基因的DNA、mRNA 和蛋白可视化的活细胞成像技术，缺少了能更好地研究内源基因的表达调控，为疾病病理、再生医学等研究工作提供有力的基因可视化工具。

发明内容

为了解决背景技术中存在的瓶颈和问题，本发明的目标是提供一种可以被广泛采用的，能够对内源基因同时实现DNA、mRNA和蛋白可视化的标签及成像方法。本发明主要运用于对基因表达调控的可视化工作中。

为此，本发明所采用的技术方案如下：

一、一种活细胞内同时可视化基因的DNA、mRNA和蛋白的TriTag标签，由三个部分的DNA序列构成：

用于基因可视化的CRISPR-Tag DNA序列，由12个TS1重复单元组成的 TS1_12x DNA序列，如SEQ ID No.1，作为组装TriTag标签的CRISPR-Tag DNA 序列；用于基因可视化的CRISPR-Tag DNA序列为活细胞基因可视化标签，通过结合dCas9-GFP_14x荧光融合蛋白而实现基因可视化。

用于RNA可视化的MS2 DNA序列，由12个MS2V5单元序列组成，如 SEQ ID No.2，作为组装TriTag标签的MS2 DNA序列；

用于蛋白可视化的含有内含子的蓝色荧光蛋白序列，如SEQ ID No.5，是由如SEQID No.3的蓝色荧光蛋白序列中插入一段如SEQ ID No.4的内含子序列后构成，能对目标内源基因产生的新生RNA进行可视化。