[发明专利]活细胞内同时可视化基因的DNA、mRNA和蛋白的标签及方法

权利要求书

1.一种活细胞内同时可视化基因的DNA、mRNA和蛋白的TriTag标签，其特征在于：由三个部分的DNA序列构成：

CRISPR-Tag DNA序列，由12个TS1重复单元组成的TS1_12x DNA序列，如SEQ ID No.1；

MS2 DNA序列，由12个MS2V5单元序列组成，如SEQ ID No.2；

含有内含子的蓝色荧光蛋白序列，如SEQ ID No.5，是由如SEQ ID No.3的蓝色荧光蛋白序列中插入一段如SEQ ID No.4的内含子序列后构成；

所述的TriTag标签是由12个TS1重复单元序列和12个MS2V5单元序列交替穿插形成如SEQ ID No.6的DNA/RNA双可视化序列，然后将该双可视化序列通过酶切连接方法插入至含有内含子的蓝色荧光蛋白序列中的内含子中而形成如SEQ ID No.7的TriTag标签。

2.一种活细胞内同时可视化基因的DNA、mRNA和蛋白的方法，其特征在于：

（一）制备构建如权利要求1所述的TriTag标签；

（二）采用TriTag标签进行活细胞内同时可视化目标内源基因的DNA、mRNA和蛋白；

（1）构建可视化稳定细胞系：

（1.1）当日，将HEK293T细胞用无PS培养基培养并铺至12孔板中形成第一细胞培养基；

（1.2）次日，进行慢病毒包装：用75 μl的减血清培养基Opti-medium预混各750 ng的dCas9-GFP_14x病毒表达质粒和stdMCP-tdTomato病毒表达质粒、705 ng的pCMV-dR8.91质粒与87 ng的PMD2.G质粒后，再加入4.5 μl的Fugene瞬时转染试剂Promega形成脂质体，滴加至第一细胞培养基的上清中，对第一细胞培养基中的HEK293T细胞进行瞬时转染；

（1.3）在步骤（1.2）瞬时转染的12小时后，吸掉第一细胞培养基上清，将第一细胞培养基更换新鲜培养基；

（1.4）在步骤（1.2）瞬时转染的48小时后，对待感染细胞进行培养并铺至24孔板中形成第二细胞培养基；

（1.5）形成第二细胞培养基24小时后，吸取步骤（1.3）更换新鲜培养基获得的第一细胞培养基上清，然后置于离心机中以800 g转速离心8分钟，离心后取上清，提取出含有病毒的细胞上清；

（1.6）配制含浓度为5 µg/mL 的基因转染增强剂polybrene的无PS培养基作为第三培养基以替换第二细胞培养基，使得待感染细胞培养转移到第三培养基，然后取30-90 μl的含有病毒的细胞上清滴加感染至待感染细胞的第三培养基上清中；

（1.7）在步骤（1.6）感染的12小时后，对第三培养基更换新鲜培养基继续培养，直至可传代至8孔板中进行显微镜成像观察，并根据荧光强度和感染效率筛选出细胞感染群体，进行96孔板单细胞克隆的分离；

（1.8）待96孔板单孔中细胞长至细胞群状态，显微镜下观察荧光强弱，进行单细胞克隆的筛选；

（2）稳定细胞系中构建包含有TriTag标签的目标内源基因可视化体系并转染分选；

（3）同时可视化目标内源基因的DNA、mRNA和蛋白并活细胞动态成像。

3.根据权利要求2所述的一种活细胞内同时可视化基因的DNA、mRNA和蛋白的方法，其特征在于：所述步骤（一）具体如下：

S1、设计并构建含有内含子的蓝色荧光蛋白序列：

采用人HSPA5基因的第4内含子序列，在该内含子序列中加入BstXI限制性酶切位点通过核酸合成的方式直接合成；

S2、设计并合成DNA/RNA双可视化序列：通过核酸合成的方式将12个TS1重复单元序列和12个MS2V5单元序列交替穿插12次合成；

S3、TriTag标签的组建：利用酶切连接方法将DNA/RNA双可视化序列插入至含有内含子的蓝色蛋白序列的内含子中获得TriTag标签。