[发明专利]一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法

说明书

本发明公开了一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，在Bca DNA聚合酶和RNase H酶的作用下，在60～65℃的温度下，SPIA的扩增反应仅需要一条混合引物即可完成。本发明可以解决RCA方法对于环化DNA的依赖及LAMP中极易出现的假阳性现象。这使得SPIA对于RCA而言具有更高的检测效率，对于LAMP而言具有更好的稳定性。SPIA方法作为一种新的核酸等温扩增技术，将更加完善、更加突出等温扩增技术的优势。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法。

背景技术

核酸体外扩增技术是分子生物学研究的基础，也是生物学分析的重要方法，通过核酸扩增可以扩增和分离目的基因，使其在临床医疗诊断、基因突变监测、分子诊断、食品安全检测及环境安全监测等领域具有重要用途。

随着分子生物学的发展与生物物理学在该领域的广泛应用,核酸扩增技术受到越来越多的关注。常见的核酸扩增技术有聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)以及滚环等温扩增(RCA)方法，这些方法都在微生物检测领域有广泛的应用，有成功的实践经验，是现今为止较为成熟的检测方法。但是每一种技术都有自身缺陷。

PCR方法作为最原始的体外核酸扩增技术，发展时间最长，也最为稳定。该方法首先需要一对引物引发扩增反应，然后经过“变性—退火(复性)—延伸”三个步骤不断的重复实现产物积累。PCR反应的基本原理为：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90～95℃一定时间后，使DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50～60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70～75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由此可见，在PCR实施过程中需要不断进行变温循环，这使得PCR的实施需要依赖于温度循环仪。该仪器现今为止价格依然昂贵，对于一些中小型企业，或是基层的检测机构而言，无疑增加了负担，对该方法的推广也增加了难度。

LAMP方法是由日本人Notomi在2000年发明的，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物(上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游外引物F3及下游外引物B3)，在链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增，具有操作简单、灵敏度高等特点。在LAMP的操作过程中，假阳性问题十分凸显。根据报道，引起LAMP假阳性的主要有两个原因，一是由于多条引物之间的相互作用，二是由于受到气溶胶的影响。但这些问题在LAMP操作中难以真正得到解决。首先，引物之间的相互作用，由于LAMP本身需要4条引物，有时为了加快反应速率，可能会使用多达6条引物，所以引物之间的发生相互作用的几率也就更大。这也为LAMP的引物设计过程也增加的更大的难度。为找到合适的引物，需要对很多套引物分别进行试验，从中挑选适宜的引物，该过程费时费力且增加成本。另外，实验室的客观条件决定了LAMP操作过程中受到气溶胶影响的可能性，想要免除气溶胶的影响，实验室需要有良好的条件，且操作人员需要有较高的素质。这些都在一定程度上限制了LAMP的推广。