[发明专利]表达CYP4V2的AAV载体及其用途

说明书

本申请涉及一种载体，所述载体包含编码CYP4V2的多核苷酸和启动子，所述启动子与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。本申请所述的载体具有好的表达效果，表达速度快，且表达强度更为稳定。本申请还提供了包含所述载体的细胞核药物组合物，以及它们在制备药物中的用途。

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种重组AAV载体，所述AAV载体可以表达CYP4V2蛋白。

背景技术

结晶样视网膜变性(Bietti’s crystalline dystrophy，BCD)是一种视网膜变性罕见病，其症状主要包括角膜中的晶体(透明覆盖物)，沉积在视网膜的光敏组织中的细小、黄色或白色晶体状的沉积物，以及视网膜、脉络膜毛细血管和脉络膜的进行性萎缩。沉积物会损伤视网膜，导致视力逐渐丧失。患有结晶样视网膜变性的人通常会在十几岁或二十几岁时开始察觉到视力问题，每只眼睛的视力问题可能以不同的速度恶化，即使在同一个家庭中症状的严重程度和进展在不同的个体中差异很大，然而大多数患者在四十或五十岁时就会失明。据估计，世界范围内每67,000人中有1人患有结晶样视网膜变性，在东亚人中更为常见，尤其是中国人和日本人。

现有研究表明BCD为常染色体隐性遗传疾病，并且是由CYP4V2基因突变引起的，目前国内外关于BCD患者的基因研究中已发现CYP4V2多个基因突变位点。CYP4V2基因是细胞色素P450超家族中的蛋白质之一，CYP4V2基因编码蛋白参与脂肪酸代谢的过程，一般认为结晶样视网膜变性中CYP4V2基因突变破坏了其参与脂肪酸代谢的酶功能，从而影响了脂质分解。然而CYP4V2如何导致了BCD的特定体征和症状尚不清楚。目前BCD的治疗主要参考视网膜色素变性(RP)的治疗方法，虽然CYP4V2基因突变的研究为未来的基因治疗提供了可能，但是目前还没有效的治疗方法。

发明内容

本申请提供了一种载体，所述载体包含编码CYP4V2的多核苷酸和启动子，所述启动子与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。本申请所述的载体具有好的表达效果，表达速度快，且表达强度更为稳定，不仅能在视网膜的RPE细胞中表达，还可以有效地在感光细胞层表达，表达范围广，可以发挥更好的治疗效果。本申请的载体核/或包含所述载体的组合物，能够有效减少CYP4V2基因突变的RPE细胞的脂质沉积情况，恢复BCD患者的受损的脂肪酸代谢、脂质分解的正常功能，恢复BCD病人RPE细胞的吞噬能力，并增强正常人RPE细胞的吞噬能力，且能够显著提高BCD小鼠视网膜电图的波幅，改善BCD小鼠的视网膜功能，以及改善BCD小鼠的RPE细胞形态，维持RPE细胞数目。总的来说，本申请提供了一种包含特定的CYP4V2基因序列和启动子序列的载体，且能够显著提高CYP4V2蛋白表达效果、有效改善视网膜功能、预防或治疗BCD。本申请所述的载体在细胞、类器官以及动物水平等不同层面都具有有效性和实用性，这对于日后在人体的应用具有非常高的指导意义。

一方面，本申请提供了一种载体，所述载体包含编码CYP4V2的多核苷酸和启动子，所述启动子与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述启动子包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。在某些实施方式中，所述多聚腺苷酸信号位点包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

在某些实施方式中，所述载体包括病毒载体。在某些实施方式中，所述病毒载体包括AAV载体。在某些实施方式中，所述病毒载体包括重组病毒载体。在某些实施方式中，所述病毒载体包括重组AAV2/8载体。在某些实施方式中，所述病毒载体包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。