[发明专利]一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法

说明书

本发明涉及转基因斑马鱼的培育方法，旨在提供一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法。通过观察胚胎红色荧光蛋白基因的表达情况，挑选出肠道有特异性荧光的斑马鱼胚胎，以采用人工饲养方法获得杂交子代。通过杂交子代自交获得稳定遗传的肠道表达红色荧光蛋白斑马鱼，再将其与野生型斑马鱼测交，筛出100％肠道表达红色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。本发明方法实施过程简单易控，能够获得肠道特异性表达的启动子和红色荧光蛋白在肠道高效表达的斑马鱼品系；所得斑马鱼品系用于斑马鱼肠道功能的研究，可以随时观察在任何时期的肠道红色荧光蛋白表达特征，满足对斑马鱼肠道功能研究的整体性与完整性要求。

技术领域

本发明涉及转基因斑马鱼的培育方法，特别是涉及一种获得肠道表达红色荧光蛋白斑马鱼的培育方法，和一个用于该培育方法的专用启动子。

背景技术

斑马鱼(Denio Rerio)为鲤科短担尼尔属，饲养简易且繁殖能力较强，鱼卵在体外受精并发育，受精卵发育迅速，胚胎时期各器官原基基本形成，生长周期短，可以进行大规模的基因突变与筛选，且斑马鱼胚胎通体透明，可利用光学仪器对体内生理过程进行可视化分析，这些特点使其成为重要的脊椎动物模型之一。

迄今为止，斑马鱼仅有少数消化道特异性表达的启动子被发现，其中包括ifabp基因的启动子。斑马鱼ifabp基因编码肠道脂肪酸结合蛋白，在斑马鱼肠道上皮细胞中特异性表达。斑马鱼ifabp基因长度为3295bp，其启动子位于该基因上游192-5000bp，在胚胎发育时期即可发挥作用。Guor Mour Her等验证了该基因的启动子可驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎肠道中短暂表达，并获得了稳定肠道表达绿色荧光蛋白GFP及红色荧光蛋白RFP的转基因斑马鱼。

DsRed基因编码的蛋白质(以下简称DsRed)由225个氨基酸组成，相对分子质量27.6kDa，激发光554nm，荧光波长586nm。与其他荧光蛋白如GFP和RFP等相比，DsRed的激发和发射波长较长，其发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，具有较高的信噪比，而且在细胞内荧光转换效率高，更易检测。DsRed对pH值不敏感，pH值为4.5～12时仍保持稳定，这使其使用范围更加广泛。但目前尚无可在肠道稳定表达Dsred红色荧光蛋白的转基因斑马鱼品系。

斑马鱼胚胎发育过程中，肠道发育位置与卵黄十分接近，转基因斑马鱼的肠道特异性荧光极易被卵黄强烈的自发荧光所影响，因而在转基因斑马鱼的培育过程中降低了筛选与育种的效率。构建肠道稳定表达Dsred红色荧光蛋白的转基因斑马鱼品系，能够使肠道特异性荧光的更易检测与观察，能够在培育过程中，获得较高的筛选效率和荧光蛋白表达效率。因此，培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼由其现实需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法，是以Tol2转座酶系统为工具，构建以肠道脂肪酸结合蛋白启动子带动DsRed红色荧光蛋白在肠道特异表达的转基因斑马鱼；该方法具体包括以下步骤：

(1)从斑马鱼肠道组织基因组扩增获得肠道特异性启动子Pifabp，其序列如SEQID NO:1所示；

(2)从商品化质粒中扩增获得dsred片段，其序列如SEQ ID NO:2所示；

(3)以mini Tol2质粒为骨架，构建基于肠道特异性启动子Pifabp表达红色荧光蛋白dsred的重组表达载体；

(4)将步骤(3)中的重组表达载体显微注射至斑马鱼受精卵，筛选出存在红色荧光信号的胚胎，并按常规方法饲养，得到F0代；