[发明专利]一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法

权利要求书

1.一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法，其特征在于，是以Tol2转座酶系统为工具，构建以肠道脂肪酸结合蛋白启动子带动DsRed红色荧光蛋白在肠道特异表达的转基因斑马鱼；该方法具体包括以下步骤：

(1)从斑马鱼肠道组织基因组扩增获得肠道特异性启动子Pifabp，其序列如SEQ IDNO:1所示；

(2)从商品化质粒中扩增获得dsred片段，其序列如SEQ ID NO:2所示；

(3)以mini Tol2质粒为骨架，构建基于肠道特异性启动子Pifabp表达红色荧光蛋白dsred的重组表达载体；

(4)将步骤(3)中的重组表达载体显微注射至斑马鱼受精卵，筛选出存在红色荧光信号的胚胎，并按常规方法饲养，得到F0代；

(5)将F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交获得F1代，筛选获得杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；

(6)将F1代斑马鱼进行自交获得F2代，筛选得到纯合及杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；

(7)将F2代斑马鱼与野生型斑马鱼测交，筛选出后代100％肠道表达红色荧光蛋白对应的F2代亲本斑马鱼，作为纯品系留种保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，启动子Pifabp的扩增过程包括：

(1.1)从成年斑马鱼的肠道组织中获取基因组DNA；

(1.2)设计并合成巢式PCR引物，其序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:6所示；

(1.3)以步骤(1.1)中提取的斑马鱼基因组为模板，利用步骤(1.2)所述引物进行两轮巢式PCR扩增，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，dsred片段的扩增过程包括：

(2.1)根据dsred商品化质粒的图谱，设计并合成特异性引物，其序列如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所示；在所述引物上加悬挂序列，用于与ifabp启动子及pTol2质粒融合；

(2.2)以dsred商品化质粒为模板，利用步骤(2.1)所述引物进行PCR扩增，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，构建重组表达载体的过程包括：

(3.1)以纯化的启动子Pifabp和dsred片段为模板进行融合PCR，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化；

(3.2)根据miniTol2质粒图谱，设计并合成特异性引物，其序列如SEQ ID NO:9-SEQ IDNO:10所示；在所述引物上加悬挂序列，用于PCR扩增获得用于克隆的线性化质粒；

(3.3)以miniTol2质粒为模板，利用步骤(3.2)所述引物进行PCR扩增，获得用于克隆的线性化质粒，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化；纯化产物用DpnI酶切，去除质粒模板，并将酶切产物纯化回收；

(3.4)利用步骤(3.1)所得Pifabp-dsred融合片段和步骤(3.3)所得线性化质粒进行一步克隆，然后将克隆质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态中；

(3.5)挑取单菌落进行培养，以Pifabp-dsred融合片段为阳性对照，取菌液进行PCR鉴定；对PCR产物鉴定为阳性克隆的进行测序比对，保存测序完全正确的阳性克隆对应的菌液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，在斑马鱼受精卵产下后1小时内，将步骤(3)获得的重组表达载体通过显微注射导入斑马鱼单细胞阶段受精卵中；按常规方法饲养，将其定为F0代。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，待F0代发育至性成熟后，将其与WB野生型斑马鱼进行测交；获取3dpf及5dpf的胚胎，观察并筛选肠道中有红色荧光特异性表达的胚胎；按常规方法饲养，并将其定为F1代。