[发明专利]一种检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的方法

说明书

本发明公开了一种检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的方法。包括：(1)将已知浓度的四环素类耐药基因tetA的标准样品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应，利用设计引物序列对模板DNA进行定量PCR扩增，记录得到的循环数；(2)运用10倍梯度稀释法，利用已知浓度模板起始拷贝数标准样品做出目的基因的标准曲线；(3)按照步骤(1)方法确定大气环境样品中四环素类耐药基因tetA的循环数，利用步骤(2)绘制的标准曲线，计算得到目标基因tetA的含量。本发明使用定量PCR技术即可快速精确地检测到大气环境中待测样品中四环素耐药基因tetA的浓度含量。

技术领域

本发明属于环境生物学领域，具体涉及一种检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的方法。

背景技术

空气污染严重影响着人类健康，特别是在工业化和城市化快速崛起的发展中国家，大气中颗粒物的增加，导致公共健康存在极大潜在风险。近年来，我国华北地区持续出现多起时间较长的雾霾重污染天气，大气污染随之也被提升到国家重点治理层面。

抗生素是指由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，是一种能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质，现已广泛用于医疗及畜禽养殖等行业。在为人类带来重要贡献的同时，抗生素的大量使用，导致人体及动物肠道内诱导出抗性菌株，以排泄物等形式释放到环境中，并可通过与细胞中的可移动因子(如质粒、转座子、基因盒等)相结合，在不同的细菌群体间传播，进而扩散到水、大气、土壤等各种环境介质中，造成抗生素耐药基因污染。抗生素滥用造成的环境污染问题已引起全球的高度重视。

到目前为止，尽管大量文献报道了有关抗生素耐药基因方面的研究，但对大气环境中耐药基因的研究甚少，尤其是对近年来引起极度重视的雾霾天气中PM_2.5和PM₁₀耐药基因的研究更少。细菌作为PM_2.5和PM₁₀中丰富的原核生物，在一定条件下可诱导为耐药菌，对人体产生直接或间接影响。尤其在雾霾环境下，暴露在高浓度PM_2.5和PM₁₀中的人群，很容易吸入携带抗生素耐药基因的病原微生物。因此，为深入研究大气环境中耐药基因的来源、分布及传播扩散机理，大气中耐药基因的检测是当务之急。

四环素类耐药基因作为在水、土壤、大气等环境介质中检测到最广泛的基因类型之一，目前研究其耐药性主要采用可培养微生物法，然而此方法对不可培养微生物的耐药基因却无法检测。

发明内容

本发明的目的是解决不可培养微生物的耐药基因在大气环境中无法被检测的问题，提供一种检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的方法，并快速精确地定量。

本发明运用定量PCR技术定量研究大气环境中耐药基因的含量特征。定量PCR技术是指通过设计目标基因引物，根据标准曲线对目标基因进行定量分析的方法。该方法可同时检测环境中不可培养微生物所携带的耐药基因，尤其对大气环境中含量相对较低的微生物中耐药基因的检测具有较好的技术优势，对深入研究大气环境中耐药基因对人类公共健康的环境风险具有重要理论意义。

本发明的技术方案

一种检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的引物序列，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：

正向引物(SEQ ID NO：1)：GCTACATCCTGCTTGCCTTC；

反向引物(SEQ ID NO：2)：CATAGATCGCCGTGAAGAGG。

一种检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的方法，是通过以上设计的正向和反向引物来检测的，其具体方法为：