[发明专利]一种检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的方法

权利要求书

1.一种检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，碱基序列为：

正向引物：GCTACATCCTGCTTGCCTTC；

反向引物：CATAGATCGCCGTGAAGAGG。

2.一种利用权利要求1所述的引物序列检测大气环境中四环素类耐药基因tetA的方法，其特征在于，包括：

(1)将已知浓度的四环素类耐药基因tetA的标准样品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应；提取标准样品四环素类耐药基因tetA中的DNA，以此提取出来的DNA作为模板，利用权利要求1中的引物序列对模板DNA进行定量PCR扩增，当达到荧光阈值时，记录得到的循环数；

(2)运用步骤(1)中得到的达到荧光阈值时的循环数，根据定量PCR测定目的基因tetA质粒标准样品的标准曲线；运用10倍梯度稀释法，利用已知浓度模板起始拷贝数标准样品做出目的基因的标准曲线，以标准样品的拷贝数的对数值为横坐标，以测得的C_T值为纵坐标，使标准质粒浓度分别为：10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，10⁸，确保R²0.99，扩增效率在90％-110％之间时为有效曲线；

(3)按照步骤(1)所述方法确定大气环境样品中四环素类耐药基因tetA的循环数，将得到的目标待测基因tetA的循环数代入步骤(2)绘制的标准样品的标准曲线中，计算得到目标大气环境样品中四环素类耐药基因tetA的含量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述定量PCR的反应体系为25μL：其中包括2μL的模板DNA 1-10ng，各0.5μL的正、反向引物10μM，12.5μL的2×Premix Ex TaqTM和9.5μL的无菌双蒸水；PCR扩增条件为：95℃预变性10min；40个循环的95℃保持20s进行变性，57℃保持20s进行退火和72℃保持30s进行延伸；72℃保持5min完全延伸。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用苯酚-氯仿-异戊醇抽提法将目标大气环境样品中的四环素类耐药基因tetA的DNA提取出来。

5.根据权利要求2至4任一项所述的方法，其特征在于，所述目的基因tetA质粒标准样品的制备方法如下：

采用权利要求1设计的双向引物，将从目的基因tetA标准样品提取出来的DNA作为模进行PCR扩增，从而获得扩增后的PCR产物；

将扩增后的PCR产物采用胶回收试剂盒回收并纯化，纯化后的DNA产物与载体链接后转化进E.coli DH5α感受态细胞中，加入LB培养基进行培养；

将培养好的感受态细胞涂抹在含IPTG、X-gal和青霉素的LB固体培养平板上；通过蓝白斑筛选法挑取白色重组菌斑上的阳性克隆子，用含青霉素的LB培养液扩大培养；

用质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒，切胶后送样测序，检测插入基因片断序列；符合要求的质粒作为标准样品。