[发明专利]一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体公开一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，设计了两对特异性引物，同时根据绵羊的编码肌形成蛋白(myogenin)基因设计两对内标性引物，采用多重巢式PCR检测法并结合RAPD反应体系，解决了由于胚胎丢失或胚胎细胞量太少而造成假阴性判断，提供了一种准确性更高、灵敏度更好、鉴定时间短的PCR技术。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法。

背景技术

人为控制家畜出生后代的性别比例, 对畜牧业的发展和遗传育种工作具有重要的经济意义, 特别是对于那些具有明显性别生产性能和饲养经济效益，差异的物种. 通过人为手段控制后代性别, 可以满足不同畜种不同性别的特殊生产需要, 能够极显著地提高养殖业的经济效益, 具有广阔的应用前景. 过去有人曾尝试过各种方法, 如H - Y 抗体法、FISH法、流式细胞仪分离XY 精子法等性别控制方法, 虽然这些方法在某些方面取得了一定的成功, 但在现场应用方面还存在诸多的困难和不便之处.

利用PCR 技术扩增Y 染色体特异序列进行胚胎的性别鉴定, 能够用较少的时间取得较高的可靠性, 准确率可达95%～100%. 目前, PCR 技术在牛、羊早期胚胎性别鉴定中已取得了突破性的进展, Herr于1990 年首先采用PCR 技术扩增Y 染色体特异多重复序列来鉴定牛、羊的胚胎性别, 准确率分别达到91.6 %和96.5%;同时Sinclair ,Gubbay和Koopman也都先后发现了哺乳动物的性别决定基因SRY , 通过PCR 技术来检测SRY 基因的有无便可判定胚胎的性别. 国内学者曾溢涛等通过PCR 技术鉴定奶牛胚胎性别获得成功,但在现场应用中还存在一定的困难，胚胎丢失或胚胎细胞量太少等因素会造成假阴性判断。因此,研究出一种准确性高、灵敏度好、鉴定时间短的PCR 技术势在必行。

RAPD(random amplified polymorphic DNA）即随机扩增多态性DNA标记，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于不同模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱，也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是具有一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。RAPD 分析所需的DNA 样品量极少，对于生物早期取样鉴定或在DNA 受限制的情况下是十分有利，RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上，在动物早期胚胎性别鉴定方面的研究鲜有报道，特别是针对羊早期胚胎性别鉴定方面目前还未有报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种一种羊早期胚胎性别鉴定的特异性PCR扩增引物。

本发明的另一个目的是提供一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，设计了两对特异性引物，同时根据绵羊的编码肌形成蛋白(myogenin)基因设计两对内标性引物，采用多重巢式PCR检测法并结合RAPD反应体系，解决了由于胚胎丢失或胚胎细胞量太少而造成假阴性判断，提供了一种准确性更高、灵敏度更好、鉴定时间短的PCR 技术。

为达到上述发明目的，本发明提供的具体方案如下：

一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的引物，包含A1和A2两对特异性引物，其中A1的引物序列为上游：5-AAAAGGCTTACAGATGCTG-3，下游：5-CTGCTGTGATGCTCCTTT-3，产物大小302 bp；A2的引物序列为上游：5-AAGCGCCCATTCTTTGAG-3，下游：5- TTGGCTTTCCATTTGTGAGT-3，产物大小219 bp。