[发明专利]一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定方法

权利要求书

1.一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的引物，其特征在于，包含A1和A2两对特异性引物，其中A1的引物序列为上游：5-AAAAGGCTTACAGATGCTG-3，下游：5-CTGCTGTGATGCTCCTTT-3，产物大小302 bp；A2的引物序列为上游：5-AAGCGCCCATTCTTTGAG-3，下游：5-TTGGCTTTCCATTTGTGAGT-3，产物大小219 bp。

2.根据权利要求1所述的一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定引物，其特征在于，包含权利要求1所述的A1和A2两对特异性引物，还包括B1和B2两对内标引物，其中B1的引物序列为上游5-CGTGGGCGTGTAAGGTGT-3，下游：5-CAGGCGCTCTATGTACTGGAT-3，产物大小197 bp；B2的引物序列为上游：5-AGGAAGTCGGTGTCTGTGGA-3，下游：5-ACTTTGGGCAGCCTCTGG-3，产物大小134bp。

3.一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤:

(1)胚胎的获取；

(2)DNA的提取；

(3)使用权利要求2所述的引物和步骤（2）提取的DNA，进行RAPD反应体系的配置获得RAPD试剂；

(4)PCR扩增反应：将步骤3配置得到的RAPD试剂加入EP管中，轻混后,进行第一轮扩增反应, 94 ℃变性 3 min , 94 ℃变性 20 s, 58 ℃退火 20 s, 72 ℃延伸 20 s, 共 20个循环;70 ℃延伸 1 min , 4 ℃ 保存,然后用100чL灭菌石蜡油覆盖于反应混合液之上，放入仪器，进行第二轮扩增反应, 94摄氏度预变性3min，74摄氏度退火30s，72摄氏度廷伸30s，退火温度74-60℃，每循环一次减1℃，13个循环后以60℃为退火温度进行扩増；

(5)扩增产物的电泳检测；

(6)鉴定胚胎的性别判定：凝胶成像系统中扩增条带如显示条302bp的带的则为雄性，如无则为雌性。

4.根据权利要求3所述的一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，其特征在于，步骤（3）中RAPD反应体系的配置为：标准10×PCR缓冲液2.5μL,Mg2+终浓度为1.5mmol/L；2.5mmol/L的四种脱氧核苷酸混合液2μL,每种脱氧核苷酸混合液终浓度为200μmol/L；每对引物中的前、后引物各加入1μL；基因组DNA5μL； Tag DNA聚合酶0.25μL；以无菌去离子蒸馏水补充体积至25μL。

5.根据权利要求3所述的一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，其特征在于，步骤（5）扩增产物的电泳检测包括取1mL的6 x loading buffer和5mL的PCR扩增产物加入已经做好的2％的 agarose凝胶样孔中，100V电压电泳30min，溴化乙啶(EB)染色10min。

6.一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的PCR试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述引物对。

7.根据权利要求6所述的羊早期胚胎性别的PCR试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的RAPD反应体系。