[发明专利]引物组合、试剂盒、扩增方法、A19疫苗检测中的应用

说明书

本发明属于分子生物学检测技术领域，公开了一种引物组合、试剂盒、扩增方法、A19疫苗检测中的应用，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO.4。所述试剂盒包含有：2×Taq PCR MasterMix，10μM引物组混合液，无菌双蒸水，阳性对照品布鲁氏菌2308株DNA，阴性对照品无菌双蒸水。本发明提供的引物组及PCR试剂盒可鉴别区分自然感染的布病阳性牛和A19疫苗免疫牛。与传统的病原生化鉴定方法相比，本发明提供的试剂盒操作简便、高效特异、生物安全性高、检测结果分析易于标准化，能解决目前牛布病防控中的实际生产问题。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种引物组合、试剂盒、扩增方法、A19疫苗检测中的应用，具体涉及一种引物组合、试剂盒、扩增方法、鉴别区分A19疫苗与自然感染病原检测中的应用。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病，简称“布病”。该病主要发生于牛、山羊、绵羊、骆驼、猪、鹿和犬等家畜和野生动物。动物发病的明显临床症状是公畜睾丸炎和附睾炎，母畜流产、死胎和不孕，可造成畜牧业重大损失。带菌的感染动物及其污染的产品或环境是人感染布病的主要传染源。我国自2000年以来，布病流行率呈逐年上升趋势，致使肉、奶等产品存在严重的安全隐患，不仅影响牛羊等动物产品的对外贸易，也对我国公共卫生安全造成了极大的隐患。

鉴于我国布病流行地区牛羊饲养密度相对高，动物基数大、阳性动物比例高的现状，布病流行区采取以疫苗接种为主、检疫-扑杀为辅的防控策略。在实际生产中，我国牛接种的布病疫苗主要是A19疫苗，其基因分型属于牛种生物1型。该疫苗为弱毒活疫苗，已在我国生产应用约50余年，为控制牛布病提供了重要保障。但同时也存在关键技术缺陷，影响其广泛使用。首先是A19疫苗活菌在动物体内残存时间较长，泌乳牛排菌期长、公牛生殖系统受损害的风险较高，食品公共安全隐患较大；其次是缺乏鉴别诊断标记，常规的布病血清学检测方法无法区分疫苗免疫抗体和自然感染抗体，造成疫苗接种牛与布病自然患病牛无法甄别，法定检疫措施严重受阻，病原扩散蔓延造成的疫情状态难以消除，使布病防控耗时费力且控制困难重重。

近十年家畜布病流行病学研究数据表明，我国牛布病主要以羊种和牛种3型布鲁氏菌为优势菌种型的流行病学特征，目前牛布病防控的A19疫苗属于牛种1型。鉴于以上牛布病布鲁氏菌的流行病学特征，经典的布鲁氏菌分类鉴定采取的主要方法是从菌株的形态学、生理生化反应特征及免疫学特性加以鉴定。但该鉴定方法耗时、判读结果繁琐、实验过程均以活菌为实验材料，存在实验室生物安全隐患。PCR方法以其敏感、特异、安全等优点被广泛应用于布鲁氏菌的鉴定，AMOS-PCR法可鉴别区分布鲁氏菌部分种型，但无法鉴别区分A19疫苗及其他牛种生物亚型的布鲁氏菌。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)A19疫苗为弱毒活疫苗，常规的布病血清学检测方法无法区分疫苗免疫抗体和自然感染抗体，造成疫苗接种牛与布病自然患病牛无法甄别，法定检疫措施严重受阻，从而引起布病防控中无法控制和监督动物移动。

(2)经典的布鲁氏菌分类鉴定采取的主要方法是从病料中分离培养并获得纯化的布鲁氏菌(时间周期为7d)，该实验过程中布鲁氏菌分离率低，且常规生化鉴定方法耗时(时间周期为3d)、判读结果繁琐、实验过程均以活菌为实验材料，实验过程中菌量浓度较大，存在实验室生物安全隐患，必须在生物安全三级实验室完成。