[发明专利]一种体细胞胚胎途径的槲蕨种苗组培快繁方法

说明书

本发明提供一种体细胞胚胎途径的槲蕨种苗组培快繁方法，包括如下步骤：外植体的获得；外植体预培养；外植体继代培养；体细胞胚胎分离和接种培养。本发明的方法可以快速得到槲蕨的体细胞胚胎，促进种苗的形成，提高繁殖效率，将对槲蕨野生资源的保护和开发利用发挥重要的促进作用。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种基于体细胞胚胎途径的槲蕨组培快繁方法。

背景技术

槲蕨(Drynaria roosii)，又名石岩姜、岩连姜、猴姜，属于槲蕨科(Drynariaceae)槲蕨属的中型附生蕨类。在我国主要分布于浙江、福建、台湾、广东、广西、江西、湖北、四川、贵州、云南等地。槲蕨为中型附生蕨类，其根状茎以骨碎补入药，作为骨碎补正品被收载于《中国药典》(周铜水和周荣汉，1998)。研究发现，槲蕨根状茎中的柚皮甙和总黄酮含量均高于其它同类植物，是骨碎补中具有活血去瘀、接骨疗伤和增强心肌细胞机能作用的主要活性成分(周铜水等，1997；周荣汉和段金廒，2005)。目前市售的骨碎补药材70％来源于槲蕨根状茎(周铜水和周荣汉,1998)，然而，人工繁殖和栽培槲蕨的工作刚刚起步，传统的槲蕨药材完全来源于野生槲蕨的采挖。由于市场需求量大，导致野生槲蕨资源被过度开采，也严重破坏了槲蕨生存的生态环境。2002年，槲蕨已被建议列入国家濒危保护植物名录(张宪春，2002)。开展对槲蕨的人工繁育技术研究有助于促进槲蕨产业发展、保护槲蕨野生资源、缓解生态环境恶化。

近年来槲蕨的人工繁殖技术已有一些报道，专利《槲蕨的一种繁殖方法》(CN1788549A)首次建立了槲蕨的离体培养体系，随后，专利《一种槲蕨的快速繁殖方法》(CN103430853A)和专利《一种槲蕨的离体保存方法》(CN105660415A)分别报道了基于组培技术对槲蕨进行愈伤诱导离体快繁和离体保存的方法。另外，专利《一种槲蕨种苗周年繁育方法》(CN106613809A)、《一种槲蕨人工繁殖方法》(CN109691372A)、《一种提高槲蕨根茎繁殖率的方法》(CN110337926A)均对槲蕨人工栽培技术进行了研究报道。

槲蕨孢子播种生长缓慢，且存在萌发率低、生长周期长等问题。组织培养因具有不受环境、时间等外界因素的影响和高效等特点，被广泛的运用于植物的规模化生产和科学研究中。目前报道的槲蕨组织培养体系所用外植体为成熟孢子，从孢子采集、灭菌培养到得到种苗依然需要较长时间。受孢子量和生活力的影响，若想周年生产，需要一个专门培养成年植株收获孢子的苗圃，不然孢子量不能保证，野外采集还可能出现不同种孢子混杂的风险，不是很适合槲蕨种苗的规模化生产。

专利《一种槲蕨的快速繁殖方法》(CN103430853A)的组培体系报道了愈伤组织的获得和四倍体的诱导，但由于愈伤组织易发生变异，若采用愈伤增殖分化的方法，对于槲蕨的大规模人工繁殖存在一定的风险。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种基于体细胞胚胎途径的槲蕨种苗离体快繁方法，该发明可以快速得到槲蕨的体细胞胚胎，促进种苗的形成，提高繁殖效率，将对槲蕨野生资源的保护和开发利用发挥重要的促进作用。

本发明的方法包括如下步骤：外植体的获得；外植体预培养；外植体继代培养；体细胞胚胎分离和接种培养。

外植体的获得：将槲蕨孢子无菌播种于孢子萌发培养基中，置于培养室，待孢子萌发并发育至配子体时期，在培养容器中添加无菌水，促进幼孢子体的形成。

外植体预培养：以1/2MS为基本培养基，添加一定浓度的6-BA、7g/L琼脂、3％蔗糖，在高温高压灭菌前将pH调至5.8，得到诱导体细胞胚的培养基，将幼孢子体叶片剪下接种至该培养基中，置于培养室预培养7天。

其中，所述的诱导体细胞胚的培养基为添加0-3mg/L6-BA、3％蔗糖的1/2MS培养基，优选的，所述的诱导体细胞胚的培养基为添加0.5-2mg/L 6-BA、3％蔗糖的1/2MS培养基，更优选的，所述的诱导体细胞胚的培养基为添加1mg/L 6-BA、3％蔗糖的1/2MS培养基。