[发明专利]一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法

说明书

本发明属于电化学和分析化学领域，具体涉及一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法。在MB和p‑NP存在的情况下，AuNPs@ZnSeNSs/GE在0V时产生强的光电流，具有自供能特性，结合原位重组酶聚合酶扩增策略，建立了一种前列腺癌循环肿瘤DNA KLK2液体活检新方法。该方法测定KLK2具有高的灵敏度，检测限为30aM，方法简单。

技术领域

本发明属于电化学和分析化学领域，具体涉及一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法。

背景技术

在影像学检查显示出明显的癌症发病迹象前，癌症患者外周血中已经出现循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。ctDNA是癌症病人血液中肿瘤源性的游离DNA(cell- free DNA，cfDNA)。ctDNA主要来源于坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞和肿瘤细胞分泌的外排体，在肿瘤病人血浆中的含量最高。液体活检是一种非侵入式检测技术，它是以体液为样品，实现对疾病标志物含量测定的一种分析方法。利用液体活检技术对体液中ctDNA高灵敏度测定具有重要意义。但是，ctDNA仅占cfDNA的0.1％～5％，且不同癌种、不同病程的癌症患者ctDNA在体液中含量差异较大。如何提高液体活检对极微量肿瘤来源核酸等标志物检测的灵敏度和选择性，仍是一个极具挑战的研究课题。建立灵敏度高、特异性强的ctDNA液体活检方法具有重要理论意义和实用价值。因此，该发明提供了一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法，具有方法简单、灵敏度高的特点。

发明内容

本发明旨在发明一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法。

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法。

实现本发明目的技术方案是：

首先，将AuNPs@ZnSeNSs修饰到GE上，然后通过Au-S键将FP固定在 AuNPs@ZnSeNSs/GE上。加入含有KLK2的样品后，电极表面的FP和溶液中的RP在重组酶聚合酶存在下进行RPA扩增。在电极上扩增了靶标，并在电极表面捕获了RP。洗涤后，St-ALP通过生物素和链霉亲和素之间的亲和作用连接在电极上。ALP催化水解p-NPP为p-NP。由于ALP的高催化活性，产生了许多p-NP。在MB和p-NP的作用下产生强的光电信号，根据PEC信号强度实现KLK2含量的测定。由于MB和p-NP共调控作用、MB的循环，以及重组酶聚合酶扩增实现了目标物的高灵敏度检测。在MB和p-NP存在的情况下， AuNPs@ZnSeNSs/GE在0V时产生强的光电流，具有自供能特性，结合原位重组酶聚合酶扩增策略，建立了一种前列腺癌循环肿瘤DNAKLK2液体活检新方法。该方法测定KLK2具有高的灵敏度，检测限为30aM。这种自供能光电化学结合原位重组酶聚合酶扩增传感为PEC分析方法发展开辟了新的道路。提供一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法。

本发明是通过以下措施来实现的：一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)ZnSe纳米片的制备；

(3)KLK2检测；

(4)电化学和光电化学测量。

优选的，所述的ZnSe纳米片的制备包括以下步骤：

通过超声剥离方法剥离得到ZnSe纳米片(ZnSeNSs)。首先，将0.1 mg～450mg的ZnSe加到1mL～150mL DMF溶液中，然后将混合物通过超声分散0.1h～100h，以获得黄色分散液。接下来，在14,000rpm条件下离心20min，从分散液中分离出剥离的ZnSe，并用乙醇洗涤3次。最后，将ZnSeNSs悬浮液用于下一实验。