[发明专利]一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法

权利要求书

1.一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法，其特征在于，首先，将AuNPs@ZnSeNSs修饰到GE上，然后通过Au-S键将FP固定在AuNPs@ZnSeNSs/GE上；加入含有KLK2的样品后，电极表面的FP和溶液中的RP在重组酶聚合酶的存在下进行RPA扩增；在电极上扩增了靶标，并在电极表面捕获了RP；洗涤后，St-ALP通过生物素和链霉亲和素之间的亲和作用连接在电极上；ALP催化水解p-NPP为p-NP；由于ALP的高催化活性，产生了许多p-NP；在MB和p-NP的作用下产生强的光电信号，根据PEC信号强度实现KLK2含量的测定；由于MB和p-NP共调控作用、MB的循环，以及重组酶聚合酶扩增实现了目标物的高灵敏度检测；在MB和p-NP存在的情况下，AuNPs@ZnSeNSs/GE在0V时产生强的光电流，具有自供能特性，结合原位重组酶聚合酶扩增策略，建立了一种前列腺癌循环肿瘤DNA KLK2液体活检新方法；具体步骤为：

ZnSe纳米片的制备包括以下步骤：

通过超声剥离方法剥离得到ZnSe纳米片；首先，将0.1mg～450mg的ZnSe加到1mL～150mL DMF溶液中，然后将混合物通过超声分散0.1h～100h，以获得黄色分散液；接下来，在14,000rpm条件下离心20min，从分散液中分离出剥离的ZnSe，并用乙醇洗涤3次；最后，将ZnSeNSs悬浮液用于下一实验；

AuNPs@ZnSeNSs的合成包括以下步骤：

通过原位生长法制备AuNPs@ZnSeNSs；将0.1mL～30mL ZnSeNSs和0.1mL～10mLHAuCl₄·4H₂O加入到烧瓶中，在搅拌下通过油浴加热至115℃；溶液继续回流并搅拌3分钟；然后，将0.1mL～10mL 1.66mg/mL的柠檬酸钠溶液滴入烧瓶中；将该混合物在115℃下回流3分钟，得到黑色的AuNPs@ZnSeNSs；在14,000rpm条件下离心10min，收集最终的黑色沉淀物；在AuNPs@ZnSeNSs的合成方法中，不同质量的氯金酸会影响PEC信号；ZnSeNSs与氯金酸的质量比分别为1:0.2、1:0.33、1:0.66、1:1、1:1.5；

KLK2检测包括以下步骤：

将1μL～60μL AuNPs@ZnSeNSs滴到金电极表面，并在空气中自然干燥；然后将1μL～60μL的10mM TCEP加到1μL～60μL的10μM FP溶液中，将混合物溶液在37℃下孵育；60分钟后，将1μL～60μL混合物添加到AuNPs@ZnSeNSs/GE的表面，并在37℃条件下孵育2小时，得到FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE；然后，将FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE浸入1mM MCH溶液中1h以消除非特异性吸附；接下来，制备RPA溶液用于KLK2基因的表面扩增；RPA反应溶液由2.4μL 10μM RP，13.2μL不含DNase的水，31.9μL重组酶聚合酶缓冲溶液和2.5μL280mM醋酸镁溶液制成；然后将1μL～50μL该RPA溶液和1μL～50μL含KLK2的样品添加到FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE的表面上；在37℃扩增30分钟后，电极用0.1M PBS洗涤；最后，将电极浸入2μL～60μL 1μM St-ALP溶液中，在37℃下孵育30分钟，用0.1M PBS洗涤电极，将电极插入p-NPP和MB的溶液中，ALP催化水解p-NPP为p-NP；在MB和p-NP的作用下产生强的光电信号，根据PEC信号强度实现KLK2含量的测定。

正向引物、反向引物和KLK2基因的序列如下：

KLK2正向引物(FP)：5'-SH-GGGGGTCCACTTGTCTGTAA-3'

KLK2反向引物(RP)5'-GGTGAGTTCCAAGCTTCAGG-biotin-3'

KLK2基因：5'-GGGGGTCCA CTTGTCTGTA ATGGTGTGCT TCAAGGTATC ACATCATGGGGCCCTGAGCC ATGTGCCCTG CCTGAAAAGC CTGCTGTGTA CACCAAGGTG GTGCATTACC GGAAGTGGATCAAGGACACC ATCGCAGCCA ACCCCTGAGT GCCCCTGTCC CACCCCTACC TCTAGTAAAT TTAAGTCCACCTCACGTTCT GGCATCACTT GGCCTTTCTG GATGCTGGAC ACCTGAAGCT TGGAACTCAC C-3' 。

2.根据权利要求1所述的一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法，其所用的试剂和仪器如下：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)、巯基乙胺(MCH)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(St-ALP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)由Sangon Biotech Co.，Ltd.(中国，上海)提供；TwistAmp Basic RT-RPA试剂盒(Twist-DX)、重组酶聚合酶缓冲溶液从Babraham(UK)购买的；生物素标记的反向引物(RP)、巯基化正向引物(FP)由Sangon Biotech Co.，Ltd.(中国，上海)合成，

聚丙烯酰胺凝胶电泳分析是使用ADYCP-31E电泳仪，购于WoDeLife SciencesInstrument Co.，Ltd.；所有光致电化学测量均在CHI660E电化学工作站上进行，购于上海辰华仪器有限公司。