[发明专利]一种甲状腺癌早期诊断、检测或者筛查的试剂盒及其使用方法、应用

说明书

本发明公开了一种甲状腺癌早期诊断、检测或者筛查的试剂盒及其使用方法、应用。该试剂盒包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因为BNC1和ACTB。本发明试剂盒能够显著提高早期甲状腺癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。

技术领域

本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于甲状腺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法、应用，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个目标基因靶点(例如BNC1和NR2F1)的甲基化状态来用于甲状腺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，此外，本发明还涉及上述检测试剂盒在生物医学中的应用。

背景技术

甲状腺癌发病率占内分泌肿瘤的首位，也是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。2018年全国最新癌症报告指出甲状腺癌主要出现在女性人群中，发达国家女性甲状腺癌发病排名第7位，发展中国家女性甲状腺癌发病排名第9位。我国东部地区甲状腺癌发病率远高于中、西部地区，女性发病率远高于男性。甲状腺癌是30岁以下女性人群的最主要癌症类型。近年来，我国甲状腺癌发病率明显上升，但死亡率则相对稳定在较低水平，其他国家也发现了类似趋势，这可能与甲状腺癌的过度诊断有关。我国甲状腺癌发病率存在地区差异，这可能是由于不同地区甲状腺癌筛查率不同所导致的。

甲状腺结节是指甲状腺细胞在局部异常生长所引起的散在病变。颈部超声检查是对甲状腺结节进行初始癌症风险分层的主要检查方法，随后决定是否对可疑结节进行细针穿刺活检(fine needle aspiration biopsy，FNAB)。然而，在某些情况下，由于恶性和良性甲状腺结节之间的细胞学特征重叠，约20％至40％的术前活检组织难以将良性甲状腺结节与甲状腺癌区分开来。此外，实验室血清学检查(促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白(Tg)及降钙素(Ct))也是目前临床上鉴别良恶性结节的常用方法，但由于其在甲状腺非肿瘤疾病中也存在较高的含量，从而特异性较低。报道指出TC诊断的不确定性仅在美国每年就导致多达50,000名患者接受不必要的甲状腺切除术。因此，传统的TC患者诊断方法的补充和完善仍然是亟待解决的问题。

DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，且具有组织特异性，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。肿瘤患者外周血中可检测到肿瘤细胞坏死、凋亡所释放的ctDNA(circulating tumorDNA)，由于其携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变，理论上可以利用ctDNA甲基化对肿瘤进行诊断。研究表明，多个抑癌基因如CDKN2A、RASSF1、ECAD、NIS-L、ATM等在甲状腺癌中都有相当高的比例因发生甲基化而失活。

发明内容

在上述资料的基础上，我们通过更加广泛和深入的研究，发现了可用于早期甲状腺癌筛查的更好的甲基化基因靶点，并设计出数套可针对这些靶点进行甲基化检测的引物及探针组合，利用新发现的基因靶标检测组合制成了早期甲状腺癌的检测和筛查以及甲状腺良性和恶性结节鉴别的试剂盒。

本发明的目的在于提供一种用于甲状腺癌早期诊断、检测或者筛查的血液单基因检测引物探针组合试剂盒，以解决现有技术中存在的检测方法特异性和敏感性过低的缺陷。

本发明的第一方面在于提供一种甲状腺癌早期诊断、检测或者筛查的试剂盒，包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因为BNC1和ACTB。